1．1965年中國(guó)科學(xué)家人工合成了具有生物活性的結(jié)晶牛胰島素，摘取了人工合成蛋白質(zhì)的桂冠，如圖是利用基因工程生產(chǎn)人胰島素過(guò)程中使用的質(zhì)粒及目的基因的部分結(jié)構(gòu)。請(qǐng)回答下列問(wèn)題。
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（1）質(zhì)粒上ori序列的堿基特點(diǎn)是 比值較高，圖示胰島素基因的轉(zhuǎn)錄以 鏈作為模板。
（2）在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)最好在引物的 端添加限制酶 的識(shí)別序列，PCR反應(yīng)體系中引物的延伸需要TaqDNA聚合酶，此酶需要 （離子）的激活。
（3）生產(chǎn)過(guò)程中目的基因是利用胰島B細(xì)胞中的mRNA反轉(zhuǎn)錄得到的胰島素基因，不直接使用細(xì)胞中酶切獲得的的胰島素基因原因是 。
（4）科學(xué)家運(yùn)用大引物PCR定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)胰島素第28位氨基酸實(shí)現(xiàn)了替換，獲得了速效胰島素類(lèi)似物產(chǎn)品。相關(guān)原理如圖所示。

①第一次PCR至少需要 個(gè)循環(huán)才能獲得相應(yīng)的大引物模板，第二次PCR應(yīng)選用大引物兩條鏈中的 （填“A”或“B”），若第二次PCR計(jì)劃循環(huán)n次，至少需要大引物 個(gè)。
②β-半乳糖苷酶可以分解無(wú)色的X-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，否則菌落為白色。將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種到添加了 的培養(yǎng)基上，若觀(guān)察到菌落呈現(xiàn)白色，則表明 。

2．種子大小是作物重要的產(chǎn)量性狀。研究者對(duì)野生型擬南芥（2n=10）進(jìn)行誘變篩選到一株種子增大的突變體。通過(guò)遺傳分析和測(cè)序，發(fā)現(xiàn)野生型DAI基因發(fā)生一個(gè)堿基G到A的替換，突變后的基因?yàn)殡[性基因，據(jù)此推測(cè)突變體的表型與其有關(guān)，開(kāi)展相關(guān)實(shí)驗(yàn)?；卮鹣铝袉?wèn)題：
（1）擬采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將野生型DAI基因轉(zhuǎn)入突變體植株，用PCR反應(yīng)擴(kuò)增DAI基因，用限制性?xún)?nèi)切核酸酶對(duì)PCR產(chǎn)物和 進(jìn)行切割，用DNA連接酶將兩者連接。為確保插入的DAI基因可以正常表達(dá)，其上下游序列需具備 。
（2）轉(zhuǎn)化后，T-DNA（其內(nèi)部基因在減數(shù)分裂時(shí)不發(fā)生交換）可在基因組單一位點(diǎn)插入也可以同時(shí)插入多個(gè)位點(diǎn)。在插入片段均遵循基因分離及自由組合定律的前提下，選出單端一位點(diǎn)插入的植株，并進(jìn)一步獲得目的基因穩(wěn)定遺傳的植株（如圖），用于后續(xù)驗(yàn)證突變基因與表型的關(guān)系。

①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化T₀代植株并自交，將T₁代種子播種在選擇培養(yǎng)基上，能夠萌發(fā)并生長(zhǎng)的陽(yáng)性個(gè)體即表示其基因組中插入了 。
②T₁代陽(yáng)性植株自交所得的T₂代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基，選擇陽(yáng)性率約 %的培養(yǎng)基中幼苗繼續(xù)培養(yǎng)。
③將②中選出的T₂代陽(yáng)性植株 （填“自交”、“與野生型雜交”或“與突變體雜交”）所得的T₃代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基，陽(yáng)性率達(dá)到 %的培養(yǎng)基中的幼苗即為目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植株。

3．RNA沉默是雙鏈RNA被特異性的核酸酶降解，產(chǎn)生小干擾RNA（siRNA），這些siRNA與同源的靶RNA互補(bǔ)結(jié)合，特異降解靶RNA，從而抑制基因表達(dá)。棉蚜是棉花的主要害蟲(chóng)，嚴(yán)重危害棉花的生產(chǎn)。E基因是棉蚜生長(zhǎng)發(fā)育的重要基因，為了控制棉蚜對(duì)棉花的危害，科研人員通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在棉花中表達(dá)棉蚜E基因的雙鏈RNA（dsRNA），特異性抑制棉蚜內(nèi)源E基因的表達(dá)。如圖是主要流程，請(qǐng)回答：

限制酶	識(shí)別序列和切點(diǎn)
EcoRⅠ	G↓AATTC
KpnⅠ	G↓GTACC
BamHⅠ	G↓GATCC
XbaⅠ	T↓CTAGA

（1）根據(jù)PCR1反應(yīng)體系中加入的引物1和2推測(cè)PCR2中加入的引物為 。
A．5'-AAATCTAGAAGCGACTCAAGATCATGGAGTAT-3'
B．5'-AAATCTAGACTGCCACTTCTTCAACTAATTCT-3'
C．5'-AAAGGATCCAGCGACTCAAGATCATGGAGTAT-3'
D．5'-AAAGGATCCCTGCCACTTCTTCAACTAATTCT-3'
（2）從理論上推測(cè)，PCR1第五輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物1的DNA片段所占的比例為 。圖中正義序列和反義序列中堿基排列順序 （填“大多數(shù)相同”或“大多數(shù)不同”或“相同”或“不同”）。過(guò)程①需要的工具酶除限制酶外還需要 。
（3）過(guò)程②將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到經(jīng) 處理的農(nóng)桿菌菌株后，為了確定重組質(zhì)粒已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化可以通過(guò) 驗(yàn)證。
（4）過(guò)程④愈傷組織形成棉花植株的過(guò)程稱(chēng)為 。轉(zhuǎn)基因棉花再生植株移栽到溫室后，葉片涂抹 檢測(cè)抗性，并提取DNA進(jìn)行PCR分析。
（5）科研人員采用特定的方法大量提取成功轉(zhuǎn)化的4株棉花植株葉片的基因組DNA，用HindⅢ完全消化，消化產(chǎn)物經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后與目的基因的探針雜交，其雜交帶結(jié)果如圖2所示（圖中數(shù)字2～5代表轉(zhuǎn)化成功的植株，數(shù)字1代表對(duì)照組）。下列有關(guān)分析正確的有 。
①對(duì)照組可以用非轉(zhuǎn)基因棉花的基因組DNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)
②數(shù)字3所代表的植株中目的基因插入染色中的兩個(gè)不同位置
③選擇HindⅢ進(jìn)行消化的原因是基因組DNA中一般只有1～2切點(diǎn)
④相同位置上雜交帶對(duì)應(yīng)DNA片段的脫氧核苷酸序列相同
（6）科研人員進(jìn)一步鑒定上述4號(hào)泳道對(duì)應(yīng)的植株，確定獲得一株轉(zhuǎn)基因抗性植株CZ4，CZ4連續(xù)自交兩代，則F₂中抗性植株占比為 。