酯酶結合熒光分析法可對有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥進行檢測，某研究院利用轉(zhuǎn)基因技術獲得一種催化效率高、農(nóng)藥敏感性強的微生物酯酶。

限制酶	識別序列與切割位點	限制酶	識別序列與切割位點
PstⅠ	5'-CTGCA↓G-3'	NdeⅡ	5'-↓GATC-3'
HindⅢ	5'-A↓AGCTT-3'	EcoRⅠ	5'-G↓AATTC-3'
DpnⅡ	5'-↓GATC-3'	AluⅠ	5'-AG↓CT-3'

（1）人工合成酯酶基因后通過PCR技術可實現(xiàn)擴增，為該過程提供能量的是

4種dNTP

4種dNTP

；還需要設計兩種引物，設計引物的作用是使DNA聚合酶能夠從引物的

3’端

3’端

開始連接脫氧核苷酸。為方便構建重組質(zhì)粒，需要在引物的5'端設計

HindⅢ、EcoR I

HindⅢ、EcoR I

酶的識別序列。某質(zhì)粒圖譜和目的基因的序列如圖所示，應選擇引物

①③

①③

（填數(shù)字，①-④中加粗表示識別序列前的保護堿基，增強上述酶與目的基因的結合）
①5'-CCGGAATTCATGCTTGATATGCCAATC-3'
②5'-CCCAAGCTTATGCTTGATATGCCAATC-3'
③5'-CCCAAGCTTCTAGTCGAACACAAGAAG-3'
④5'-CCGGAATTCCTAGTCGAACACAAGAAG-3'
（2）若提取高產(chǎn)酯酶野生菌的基因組DNA，用設計的引物和合適的條件進行PCR，其產(chǎn)物可用

（瓊脂糖凝膠）電泳

（瓊脂糖凝膠）電泳

鑒定。結果發(fā)現(xiàn)有目的基因以外的雜帶存在，分析可能原因是：

在基因組DNA中有其他引物結合的位點/引物特異性不強/引物過短

在基因組DNA中有其他引物結合的位點/引物特異性不強/引物過短

。解決措施：在目的基因的

上、下游

上、下游

（填“內(nèi)部”或“上、下游”）重新設計引物進行PCR。
（3）將PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒用限制酶酶切，酶切產(chǎn)物純化后，用

DNA連接酶

DNA連接酶

連接，連接產(chǎn)物導入大腸桿菌前需處理大腸桿菌，使其處于

感受態(tài)

感受態(tài)

。
（4）將目的蛋白與某些標簽融合表達形成含標簽的融合蛋白，實現(xiàn)增溶、防降解、促進分泌、便于純化和檢測等功能。6×his——Tag（組氨酸標簽）含有的咪唑基團選擇性地結合在已固定于層析介質(zhì)的Ni²⁺、Co²⁺等金屬離子上。高濃度的咪唑緩沖液可以競爭性洗脫結合在介質(zhì)上的His標簽蛋白。據(jù)此推測6×his——Tag的作用之一是

便于純化目的蛋白

便于純化目的蛋白

。