酵母菌絮凝是指菌體細(xì)胞間通過細(xì)胞壁相互粘附、聚集成團(tuán)的現(xiàn)象。適當(dāng)提高酵母的絮凝能力，有助于發(fā)酵后細(xì)胞和產(chǎn)物的分離，節(jié)約生產(chǎn)成本?？蒲腥藛T為研究R基因?qū)湍妇跄阅艿挠绊?，用基因工程技術(shù)獲得了R基因被敲除的酵母菌菌株，主要步驟如圖1（G418為一種氨基糖苷類抗生素）。請據(jù)圖回答下列問題。

（1）過程①中，引物2和引物4分別添加了MluⅠ的識別序列，則引物1和引物3的5′端分別添加

BamHⅠ、HindⅢ

BamHⅠ、HindⅢ

的識別序列，PCR獲取R基因左右兩端的N和C片段過程中，除了圖中條件外，還需提供

dNTP、Taq酶、緩沖液、Mg²⁺

dNTP、Taq酶、緩沖液、Mg²⁺

等條件（至少寫三個(gè)）。
（2）過程②所需的工具酶有

限制酶、DNA連接酶

限制酶、DNA連接酶

。過程③將構(gòu)建的重組質(zhì)粒用

MluⅠ

MluⅠ

酶將其線性化后轉(zhuǎn)化進(jìn)受體酵母菌。
（3）利用含

G418

G418

的培養(yǎng)基篩選出重組酵母，再挑取單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證酵母細(xì)胞R基因是否被敲除，則擴(kuò)增時(shí)選擇引物組合是

引物1和引物3

引物1和引物3

。
（4）科研人員繼續(xù)將野生酵母菌和R基因敲除酵母菌的菌液接種到裝有麥芽汁的錐形瓶中，一定條件下靜置發(fā)酵7天，測定酒精發(fā)酵能力和絮凝能力，結(jié)果如表。

指標(biāo)種類	酒精發(fā)酵能力	絮凝能力
野生酵母菌	4.5%	63.1%
R基因敲除酵母菌	4.5%	83.1%

①酒精發(fā)酵期間，每個(gè)錐形瓶應(yīng)注意保持

密封

密封

條件和定期排氣。
②實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，R基因敲除酵母菌是否符合生產(chǎn)需求？請說出你的判斷依據(jù)。

符合，R基因敲除后酵母菌的發(fā)酵能力不變，而絮凝能力增強(qiáng)

符合，R基因敲除后酵母菌的發(fā)酵能力不變，而絮凝能力增強(qiáng)

。
（5）科研人員進(jìn)一步研究R基因影響絮凝能力的作用機(jī)制。
①將R基因敲除酵母菌和野生酵母菌分別用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，再將不同濃度梯度的酵母菌液點(diǎn)樣于含30g/mL鈣熒光白（細(xì)胞壁抑制劑，破壞細(xì)胞壁的正常組裝）的YPD培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基中除了必需營養(yǎng)物質(zhì)外還需添加

瓊脂

瓊脂

，培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后結(jié)果如圖2。
（注：YPD培養(yǎng)基—酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）
②綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測R基因敲除酵母菌絮凝能力變化的原因是

R基因缺失增強(qiáng)了酵母菌對細(xì)胞壁抑制劑的耐性，絮凝能力增強(qiáng)

R基因缺失增強(qiáng)了酵母菌對細(xì)胞壁抑制劑的耐性，絮凝能力增強(qiáng)

。