23．PHB2蛋白具有抑制細(xì)胞增殖的作用。為初步探究某動物PHB2蛋白抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖的原因，研究者從基因數(shù)據(jù)庫中獲取了該蛋白的基因編碼序列，大小為0.9kb（1kb=1000堿基對），利用大腸桿菌表達(dá)該蛋白。回答下列問題。
（1）為獲取PHB2基因，提取該動物肝臟組織的
，再經(jīng)
過程得到cDNA，將其作為PCR反應(yīng)的模板，并設(shè)計(jì)一對特異性引物來擴(kuò)增目的基因。
（2）如圖1為所用載體圖譜示意圖，圖中限制酶的識別序列及切割位點(diǎn)見下表。為使PHB2基因（該基因序列不含圖1中限制酶的識別序列）與載體正確連接，在擴(kuò)增的PHB2基因兩端分別引入
和
兩種不同限制酶的識別序列。為此需要將兩種酶的識別序列分別設(shè)計(jì)在兩種引物的
端（填“3′”或“5′”）。雙酶切避免了目的基因于載體的
連接，同時(shí)減少目的基因與目的基因、載體與載體的連接，以提高重組質(zhì)粒的比例。經(jīng)過這兩種酶酶切的PHB2基因和載體進(jìn)行連接時(shí)，可選用
（填“E?coliDNA連接酶”或“T4DNA連接酶”）。
| 名稱 |
識別序列及切割位點(diǎn) |
名稱 |
識別序列及切割位點(diǎn) |
| HindⅢ |
A↓AGCTT |
EcoRⅠ |
G↓GATCC |
| PvitⅡ |
CAG↓CTG |
PstⅠ |
CTGC↓AG |
| KpnⅠ |
G↓GATCC |
BamHⅠ |
G↓GTACC |
（3）將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種在含
的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，隨機(jī)挑取單菌落（分別編號為1、2、3、4）培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，用（2）中選用的兩種限制酶進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，結(jié)果如圖2，
號菌落的質(zhì)粒很可能是含目的基因的重組質(zhì)粒。
（注：M為指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物；小于0.2kb的DNA分子條帶未出現(xiàn)在圖中）
（4）根據(jù)PHB2cDNA的核苷酸序列設(shè)計(jì)了相應(yīng)的引物如圖3，通過PCR擴(kuò)增PHB2基因。已知A位點(diǎn)和B位點(diǎn)分別是起始密碼子和終止密碼子對應(yīng)的基因位置。選用的引物組合應(yīng)為
，PCR擴(kuò)增時(shí)，目的基因往往只是DNA中的一個(gè)片段，類似于AB段，當(dāng)PCR擴(kuò)增至第四輪循環(huán)時(shí)等長的目的基因片段占
。
（5）將純化得到的PHB2蛋白以一定濃度添加到人宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24小時(shí)后，檢測處于細(xì)胞周期不同時(shí)期的細(xì)胞數(shù)量，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖4。分析該蛋白抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖可能的原因是將細(xì)胞阻滯在細(xì)胞周期的
（填“G
1”或“S”或“G
2/M”）期。
