PHB2蛋白具有抑制細胞增殖的作用。為初步探究某動物PHB2蛋白抑制人宮頸癌細胞增殖的原因，研究者從基因數據庫中獲取了該蛋白的基因編碼序列，大小為0.9kb（1kb=1000堿基對），利用大腸桿菌表達該蛋白?；卮鹣铝袉栴}。
（1）為獲取PHB2基因，提取該動物肝臟組織的

mRNA

mRNA

，再經

逆轉錄

逆轉錄

過程得到cDNA，將其作為PCR反應的模板，并設計一對特異性引物來擴增目的基因。
（2）如圖1為所用載體圖譜示意圖，圖中限制酶的識別序列及切割位點見下表。為使PHB2基因（該基因序列不含圖1中限制酶的識別序列）與載體正確連接，在擴增的PHB2基因兩端分別引入

PvitⅡ

PvitⅡ

和

EcoRI

EcoRI

兩種不同限制酶的識別序列。為此需要將兩種酶的識別序列分別設計在兩種引物的

5′

5′

端（填“3′”或“5′”）。雙酶切避免了目的基因于載體的

反向

反向

連接，同時減少目的基因與目的基因、載體與載體的連接，以提高重組質粒的比例。經過這兩種酶酶切的PHB2基因和載體進行連接時，可選用

T4DNA連接酶

T4DNA連接酶

（填“E?coliDNA連接酶”或“T4DNA連接酶”）。

名稱	識別序列及切割位點	名稱	識別序列及切割位點
HindⅢ	A↓AGCTT	EcoRⅠ	G↓GATCC
PvitⅡ	CAG↓CTG	PstⅠ	CTGC↓AG
KpnⅠ	G↓GATCC	BamHⅠ	G↓GTACC

（3）將轉化后的大腸桿菌接種在含

氨芐青霉素

氨芐青霉素

 的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，隨機挑取單菌落（分別編號為1、2、3、4）培養(yǎng)并提取質粒，用（2）中選用的兩種限制酶進行酶切，酶切產物經電泳分離，結果如圖2，

3

3

號菌落的質粒很可能是含目的基因的重組質粒。
（注：M為指示分子大小的標準參照物；小于0.2kb的DNA分子條帶未出現在圖中）
（4）根據PHB2cDNA的核苷酸序列設計了相應的引物如圖3，通過PCR擴增PHB2基因。已知A位點和B位點分別是起始密碼子和終止密碼子對應的基因位置。選用的引物組合應為

引物1和4

引物1和4

，PCR擴增時，目的基因往往只是DNA中的一個片段，類似于AB段，當PCR擴增至第四輪循環(huán)時等長的目的基因片段占

1

2

1

2

。
（5）將純化得到的PHB2蛋白以一定濃度添加到人宮頸癌細胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24小時后，檢測處于細胞周期不同時期的細胞數量，統計結果如圖4。分析該蛋白抑制人宮頸癌細胞增殖可能的原因是將細胞阻滯在細胞周期的

G₂/M

G₂/M

（填“G₁”或“S”或“G₂/M”）期。