苯丙酮尿癥是單基因遺傳病，科學(xué)家將正?；駾導(dǎo)入該病患者的細(xì)胞，以治療該病。圖甲為質(zhì)粒，長(zhǎng)度為2.7kb。其中Ap為氨芐青霉素抗性基因；lacZ為藍(lán)色顯色基因，其表達(dá)產(chǎn)物可以將無(wú)色化合物X-gal轉(zhuǎn)化成藍(lán)色物質(zhì)，使菌落呈藍(lán)色；EcoRⅠ（0.6Kb）、PvuⅠ（0.8Kb）為限制酶及其切割位點(diǎn)與復(fù)制原點(diǎn)之間的距離。圖乙為含有目的基因D的DNA片段?；卮鹣铝袉?wèn)題：
（1）利用PCR技術(shù)獲取目的基因D時(shí)，設(shè)計(jì)引物的依據(jù)是
目的基因D兩端的堿基序列
目的基因D兩端的堿基序列
，引物的長(zhǎng)度通常為 20～30
20～30
個(gè)核苷酸，之所以需要引物是由于 DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，只能從3′端延伸DNA鏈
DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，只能從3′端延伸DNA鏈
。在PCR反應(yīng)體系中除了引物、DNA模板之外，還有 4種脫氧核苷酸（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）、耐高溫的DNA聚合酶、Mg2+、緩沖液
4種脫氧核苷酸（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）、耐高溫的DNA聚合酶、Mg2+、緩沖液
。
（2）構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，需將目的基因D和質(zhì)粒分別用 PvuI
PvuI
進(jìn)行切割，然后它們混合在一起，添加 DNA連接
DNA連接
酶，得到的產(chǎn)物有 目的基因D正向接入的重組質(zhì)粒、目的基因D反向接入的重組質(zhì)粒、沒(méi)有接入目的基因D的質(zhì)粒自身環(huán)化的產(chǎn)物、目的基因D自身環(huán)化的產(chǎn)物
目的基因D正向接入的重組質(zhì)粒、目的基因D反向接入的重組質(zhì)粒、沒(méi)有接入目的基因D的質(zhì)粒自身環(huán)化的產(chǎn)物、目的基因D自身環(huán)化的產(chǎn)物
。
（3）為選出符合要求的重組質(zhì)粒，使用EcoRⅠ對(duì)質(zhì)粒完全酶切后，進(jìn)行電泳分析。若是符合要求的重組質(zhì)粒，電泳圖譜中出現(xiàn)條帶長(zhǎng)度為 1.2kb和5.5kb
1.2kb和5.5kb
。
（4）利用自身不含lacZ基因且對(duì)抗生素敏感的大腸桿菌作為受體細(xì)胞，要篩選出已轉(zhuǎn)化的含重組質(zhì)粒，培養(yǎng)基中應(yīng)添加 氨芐青霉素和X-gal
氨芐青霉素和X-gal
，其中符合要求的菌落為 白色菌落
白色菌落
。
