二十碳五烯酸（EPA）能促進(jìn)體內(nèi)飽和脂肪酸代謝，是人體自身不能直接合成但又不可缺少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。獲取EPA產(chǎn)品的主要途徑是從魚(yú)油等海洋漁業(yè)資源中提取。研究人員利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)從海洋細(xì)菌中提取了EPA合成途徑的關(guān)鍵基因pfaB，并將其導(dǎo)入酵母菌內(nèi)，通過(guò)酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)EPA，相關(guān)過(guò)程如圖所示，請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

（1）PCR是

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

的縮寫，是在體外大量合成DNA的技術(shù)。PCR過(guò)程中，用

90°C以上高溫

90°C以上高溫

代替了解旋酶的作用。
（2）利用PCR擴(kuò)增pfaB基因前，需設(shè)計(jì)引物

①④

①④

（填序號(hào)），理由是

DNA聚合酶只能從引物的3'端延伸DNA鏈

DNA聚合酶只能從引物的3'端延伸DNA鏈

。
（3）將pfaB基因連接在pP1C9質(zhì)粒上時(shí)所用的酶是

DNA連接酶

DNA連接酶

。
（4）將pfaB-pP1C9表達(dá)載體導(dǎo)入酵母菌前，需先將表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌并進(jìn)行篩選，篩選時(shí)培養(yǎng)基中應(yīng)加入

氨芐青霉素

氨芐青霉素

，再將含有表達(dá)載體的大腸桿菌與酵母菌置于電轉(zhuǎn)杯中，通過(guò)電激將大腸桿菌導(dǎo)入酵母菌，使該表達(dá)載體進(jìn)入酵母菌細(xì)胞中.
（5）pfaB-pP1C9表達(dá)載體在酵母菌中不會(huì)隨著其繁殖而丟失的原因是表達(dá)載體上含有

真核

真核

（填“真核”或“原核”）生物復(fù)制原點(diǎn)，能在酵母菌中復(fù)制。