融合PCR技術(shù)是采用具有互補(bǔ)末端的引物，將不同來(lái)源的擴(kuò)增片段連接起來(lái)的方法，其過(guò)程如圖1．圖2是中間載體1和中間載體2（利用融合PCR技術(shù)構(gòu)建成）構(gòu)建成葉綠體定點(diǎn)整合表達(dá)載體示意圖（限制酶酶切位點(diǎn)標(biāo)注于載體外側(cè)），葉綠體定點(diǎn)整合表達(dá)載體通過(guò)與葉綠體基因的同源重組，將目的基因整合于葉綠體 DNA的特定位點(diǎn)上。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

（1）圖1中，在第一階段獲得兩種DNA的過(guò)程中，一般須將引物1、2和引物3、4置于不同反應(yīng)系統(tǒng)中。這是因?yàn)?

引物2和3中存在互補(bǔ)配對(duì)片段，置于同一反應(yīng)系統(tǒng)時(shí)它們會(huì)發(fā)生結(jié)合而失去作用

引物2和3中存在互補(bǔ)配對(duì)片段，置于同一反應(yīng)系統(tǒng)時(shí)它們會(huì)發(fā)生結(jié)合而失去作用

。加入到PCR反應(yīng)體系的物質(zhì)，除圖中所示引物、模板DNA外，還應(yīng)包括Mg²⁺、擴(kuò)增緩沖液和

Taq酶和4種脫氧核苷酸（dCTP、dATP、dGTP、dTTP）

Taq酶和4種脫氧核苷酸（dCTP、dATP、dGTP、dTTP）

。
（2）圖1中，在引物1、引物2組成的反應(yīng)系統(tǒng)中，經(jīng)第一階段要形成圖示雙鏈DNA，至少要經(jīng)過(guò)

2

2

次復(fù)制。引物1、引物2組成的反應(yīng)系統(tǒng)和引物3、引物4組成的反應(yīng)系統(tǒng)中均進(jìn)行一次復(fù)制，共產(chǎn)生

4

4

種雙鏈DNA分子。
（3）圖2中，構(gòu)建成定點(diǎn)整合表達(dá)載體需用到的工具酶有

SpeⅠ、SalⅠ和DNA連接酶

SpeⅠ、SalⅠ和DNA連接酶

，圖中定點(diǎn)整合表達(dá)載體上未標(biāo)出的結(jié)構(gòu)是

復(fù)制原點(diǎn)

復(fù)制原點(diǎn)

。
（4）利用定點(diǎn)整合表達(dá)載體將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的葉綠體中的優(yōu)點(diǎn)是

能實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合到葉綠體中，且不易隨花粉擴(kuò)散帶來(lái)安全問(wèn)題

能實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合到葉綠體中，且不易隨花粉擴(kuò)散帶來(lái)安全問(wèn)題

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