某廠發(fā)酵使用的谷氯酸棒狀桿菌已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的“退化”，呈現(xiàn)長勢差、發(fā)酵效價不高、質(zhì)量不好等現(xiàn)象，研究人員利用保存的菌種，通過激光照射谷氨酸酸棒狀桿菌原生質(zhì)體選育出了高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的谷氨酸棒狀桿菌菌種?；卮鹣铝袉栴}：
（1）制備谷氨酸棒狀桿菌原生質(zhì)體時，常用酶解法去壁。酶解后，用較高滲透壓緩沖液經(jīng)過多次洗滌離心獲得原生質(zhì)體，多次洗滌的目的是

為了洗去酶液，防止其對原生質(zhì)體造成破壞

為了洗去酶液，防止其對原生質(zhì)體造成破壞

。谷氨酸棒狀桿菌原生質(zhì)體經(jīng)過激光照射后，接種于培養(yǎng)基上再生出細(xì)胞壁，用涂布器將

稀釋

稀釋

后的再生菌液涂布接種到高糖、高谷氨酸的固體培養(yǎng)基上，形成單菌落后再進(jìn)行鑒定和擴(kuò)大培養(yǎng)。
（2）選育出的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌種一般接種在斜面培養(yǎng)基上保存，在低溫干燥等條件下通過減少菌種的

傳代

傳代

次數(shù)來減少菌種發(fā)生自發(fā)突變的概率，開展工業(yè)發(fā)酵時，將保存的菌種

活化

活化

后再擴(kuò)大培養(yǎng)，最后接種于培養(yǎng)基中，初期調(diào)節(jié)培養(yǎng)基C/N為4：1有利于

菌體大量繁殖

菌體大量繁殖

，后期調(diào)整C/N為3：1以獲得大量谷氨酸產(chǎn)物。
（3）與利用糖蜜相比，用大米、小麥作為谷氨酸發(fā)酵的原料需要增加

將淀粉分解成小分子糖

將淀粉分解成小分子糖

的過程，從生產(chǎn)發(fā)酵罐底部通入高溫蒸汽一方面可以使淀粉等受熱吸水從細(xì)胞壁中釋放出來，另一方面也可以起到

滅菌

滅菌

的作用。
（4）生物素是脂肪酸合成的必需物質(zhì)，發(fā)酵使用的谷氨酸棒狀桿菌常為生物素缺陷型菌株，可以減少組成細(xì)胞膜的

磷脂

磷脂

分子的合成，有利于

增大細(xì)胞膜通透性，谷氨酸能及時排出胞外

增大細(xì)胞膜通透性，谷氨酸能及時排出胞外

，從而降低谷氨酸合成的負(fù)反饋作用。
（5）谷氨酸棒狀桿菌還被用于工業(yè)化生產(chǎn)丙酮酸，為了增加其代謝過程中丙酮酸的積累，研究人員利用同源重組的方法敲除了與丙酮酸分解代謝有關(guān)的基因A，獲得了A基因缺失工程菌，實驗過程包括：
I.基因敲除打靶質(zhì)粒的構(gòu)建。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出A基因的上下游序列，融合成一個DNA片段，PCR反應(yīng)體系中的原料是

四種dNTP

四種dNTP

；然后用兩種

限制性內(nèi)切核酸酶

限制性內(nèi)切核酸酶

分別切割融合片段和質(zhì)粒，再用DNA連接酶連接形成重組質(zhì)粒。
Ⅱ.重組質(zhì)粒的導(dǎo)入。將野生型谷氨酸棒狀桿菌放入低溫、低濃度的CaCl₂溶液中，使之成為

感受態(tài)

感受態(tài)

細(xì)胞，再利用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒。一段時間后將菌液涂布于平板上獲得單菌落。
Ⅲ.目標(biāo)菌的鑒定。選取單菌落，破壁后加入2mol/L的NaCl溶液，離心后取上清液，然后加入

95%的冷酒精

95%的冷酒精

，得到白色DNA，將DNA提取物加入PCR反應(yīng)體系，利用A基因的特異性引物開展擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過電泳后，凝膠中出現(xiàn)

0

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個條帶，可以初步確定該菌落是目標(biāo)菌。最后通過發(fā)酵檢測丙酮酸產(chǎn)量作為基因敲除成功的直接證據(jù)。