2021年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予了大衛(wèi)?朱利葉斯和阿登?帕塔普蒂安兩位科學(xué)家，以表彰他們?cè)诎l(fā)現(xiàn)離子通道蛋白TRPV1（辣椒素受體）等方面做出的重要貢獻(xiàn)。如圖為大衛(wèi)?朱利葉斯團(tuán)隊(duì)利用基因工程方法發(fā)現(xiàn)TRPV1的過程，請(qǐng)據(jù)圖回答：
（1）抽取背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的總RNA，并分離純化得到mRNA，再經(jīng)過 反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄，得到全部的cDNA。cDNA結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)有 沒有內(nèi)含子、沒有啟動(dòng)子沒有內(nèi)含子、沒有啟動(dòng)子（請(qǐng)寫出2點(diǎn)）。
（2）將cDNA與 基因表達(dá)載體基因表達(dá)載體連接后儲(chǔ)存在受體菌群種，獲得cDNA文庫。將cDNA文庫分為16000個(gè)克隆池，并將每個(gè)克隆池瞬時(shí)轉(zhuǎn)移到 HEK293細(xì)胞HEK293細(xì)胞中。
（3）將熒光鈣敏感染料Fura-2和辣椒素同時(shí)加入轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基，一段時(shí)間后觀察克隆池的熒光產(chǎn)生情況。若發(fā)出熒光，則說明 該池中含有能夠編碼辣椒素受體的基因該池中含有能夠編碼辣椒素受體的基因，發(fā)熒光的機(jī)理是 該受體在辣椒素刺激下開放，滲透大量Ca2+與Fura-2染料結(jié)合發(fā)出熒光該受體在辣椒素刺激下開放，滲透大量Ca2+與Fura-2染料結(jié)合發(fā)出熒光。通過對(duì)該池進(jìn)行進(jìn)一步細(xì)分和重新評(píng)估從而獲得TRPV1受體，并提取出TRPV1受體基因。
（4）已知薄荷醇能與TRPM8（感受器的受體）結(jié)合，并激活皮膚的冷覺感受器產(chǎn)生神經(jīng)沖動(dòng)。請(qǐng)你嘗試設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)尋找能夠編碼TRPM8的基因。 取背部神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的總RNA并構(gòu)建cDNA文庫，將該cDNA文庫分為若干個(gè)克隆池，每個(gè)克隆池瞬時(shí)轉(zhuǎn)移到不會(huì)對(duì)薄荷醇刺激產(chǎn)生反應(yīng)的細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞裝載Fura-2熒光染料，篩選能夠引起熒光反應(yīng)的克隆池，通過進(jìn)一步細(xì)分和重新評(píng)估，提取TRPM8基因取背部神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的總RNA并構(gòu)建cDNA文庫，將該cDNA文庫分為若干個(gè)克隆池，每個(gè)克隆池瞬時(shí)轉(zhuǎn)移到不會(huì)對(duì)薄荷醇刺激產(chǎn)生反應(yīng)的細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞裝載Fura-2熒光染料，篩選能夠引起熒光反應(yīng)的克隆池，通過進(jìn)一步細(xì)分和重新評(píng)估，提取TRPM8基因。
【考點(diǎn)】基因工程在農(nóng)牧、醫(yī)療、食品等方面的應(yīng)用；基因工程的操作過程綜合．
【答案】反轉(zhuǎn)錄；沒有內(nèi)含子、沒有啟動(dòng)子；基因表達(dá)載體；HEK293細(xì)胞；該池中含有能夠編碼辣椒素受體的基因；該受體在辣椒素刺激下開放，滲透大量Ca2+與Fura-2染料結(jié)合發(fā)出熒光；取背部神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的總RNA并構(gòu)建cDNA文庫，將該cDNA文庫分為若干個(gè)克隆池，每個(gè)克隆池瞬時(shí)轉(zhuǎn)移到不會(huì)對(duì)薄荷醇刺激產(chǎn)生反應(yīng)的細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞裝載Fura-2熒光染料，篩選能夠引起熒光反應(yīng)的克隆池，通過進(jìn)一步細(xì)分和重新評(píng)估，提取TRPM8基因
【解答】
【點(diǎn)評(píng)】
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發(fā)布：2024/6/27 10:35:59組卷：26引用：2難度：0.5
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1．人類基因組計(jì)劃測定了人體的24條染色體，這24條染色體是（ ?。?/h2>
發(fā)布：2024/12/31 0:30:1組卷：112引用：7難度：0.7 -
2．學(xué)習(xí)以下材料，回答（1）～（4）題。
利用抑制性tRNA進(jìn)行無義突變遺傳病的治療
無義突變是由于某個(gè)堿基的改變使代表某種氨基酸的密碼子突變?yōu)榻K止密碼子（UAA、UAG或UGA），從而使肽鏈合成提前終止，造成蛋白質(zhì)的功能改變，引發(fā)相關(guān)疾病。約有10%～15%的人類基因相關(guān)遺傳疾病是由無義突變引發(fā)的。常規(guī)的基因治療是將正?；虻腸DNA序列或是有治療價(jià)值的基因（如CRISPR-Cas9相關(guān)的基因編輯工具）通過一定的方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞內(nèi)，達(dá)到替代或修復(fù)缺陷基因、治療疾病的目的。導(dǎo)入基因插入位置不當(dāng)、過高或過低表達(dá)，都可能會(huì)導(dǎo)致副作用。盡管基因編輯可以實(shí)現(xiàn)生理水平的基因表達(dá)，但基因編輯工具引入外源蛋白可能引發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)仍然是巨大的挑戰(zhàn)。
抑制性tRNA（sup-tRNA）由天然tRNA改造而來，它的反密碼子通過堿基配對(duì)原則可以識(shí)別無義突變的終止密碼子，使得mRNA在翻譯至無義突變位點(diǎn)時(shí)不啟動(dòng)翻譯終止而是繼續(xù)向后進(jìn)行翻譯，獲得有功能的全長蛋白。
I型黏多糖貯積癥的病因，是相關(guān)基因發(fā)生無義突變，產(chǎn)生終止密碼子UAG。研究者構(gòu)建小鼠該突變基因mldua和Flag基因融合的載體（圖1），以及針對(duì)該無義突變?cè)O(shè)計(jì)的sup-tRNA表達(dá)載體（產(chǎn)生的sup-tRNA能夠識(shí)別UAG并攜帶酪氨酸Tyr,簡寫作sup-tRNATyr），將其導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與具有相似作用的化合物G418比較，sup--tRNA的作用更加顯著（圖2）；進(jìn)一步利用重組腺相關(guān)病毒作為載體將sup-tRNA導(dǎo)入患病小鼠模型中，實(shí)驗(yàn)顯示能夠降低黏多糖過度積存，實(shí)現(xiàn)對(duì)該病癥的有效治療，其療效可以持續(xù)半年以上。
從整體來看，G418在促進(jìn)跨越無義突變位點(diǎn)繼續(xù)翻譯時(shí)引入的氨基酸較為隨機(jī)，而sup-tRNA引入的氨基酸較為單一，且不會(huì)影響內(nèi)源tRNA穩(wěn)態(tài)，所以sup-tRNA在個(gè)體治療中具有很高的安全性，因而在未來基因突變引起的疾病相關(guān)治療中具有非常大的應(yīng)用前景。
（1）侵染時(shí)，作為載體的重組腺相關(guān)病毒與靶細(xì)胞膜上的發(fā)生識(shí)別，引發(fā)內(nèi)吞，進(jìn)入細(xì)胞后釋放單鏈DNA作為模板，利用宿主細(xì)胞的催化合成其互補(bǔ)DNA鏈，再經(jīng)過過程產(chǎn)生sup-tRNA。
（2）除了引入的氨基酸較為單一，不影響內(nèi)源tRNA穩(wěn)態(tài)，我們還可推斷，用于治療的sup-tRNA在正常終止密碼子處（填“能”或“不能”）繼續(xù)往后翻譯，具有很高的安全性。
（3）研究者構(gòu)建mldua突變基因和Flag基因融合的載體，目的是通過檢測來確定是否跨越無義突變位點(diǎn)繼續(xù)向后翻譯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相比于化合物G418，sup-tRNA在促進(jìn)無義突變位點(diǎn)的翻譯方面更加有效，支持這一結(jié)論的依據(jù)是：。
（4）有文獻(xiàn)報(bào)道，已在近1000個(gè)不同的人類基因中發(fā)現(xiàn)了7500多個(gè)無義突變。常規(guī)的基因治療需要為每種疾病設(shè)計(jì)獨(dú)特的治療策略，這將是一項(xiàng)耗費(fèi)驚人的項(xiàng)目。據(jù)此說明sup-tRNA的應(yīng)用價(jià)值。發(fā)布：2025/1/3 8:0:1組卷：27引用：1難度：0.6 -
3．幾丁質(zhì)是許多真菌細(xì)胞壁的重要成分，自然界有些植物能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶催化幾丁質(zhì)水解從而抵抗真菌感染。通過基因工程將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入沒有抗性的植物體內(nèi)，可增強(qiáng)其抗真菌的能力。如圖表示為獲取幾丁質(zhì)酶基因而建立cDNA文庫的過程。
（1）圖示以mRNA為材料通過法獲得cDNA，該方法依據(jù)的原理是，通過這種方法獲得的基因中因缺乏和結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致將其直接導(dǎo)入受體細(xì)胞中不能復(fù)制和表達(dá)。
（2）與選用老葉相比，選用嫩葉更容易提取到mRNA，原因是，且提取RNA時(shí)，提取液中需添加RNA酶抑制劑，其目的是。
（3）將從cDNA文庫中獲得的幾丁質(zhì)酶基因和質(zhì)粒載體用酶和DNA連接處理后連接起來，構(gòu)建基因表達(dá)載體，DNA連接酶催化形成的化學(xué)鍵是。發(fā)布：2025/1/5 8:0:1組卷：5引用：1難度：0.7
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