紅景天中的HMA3基因能編碼Cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，科研人員將紅景天中的HMA3基因轉(zhuǎn)入欒樹(shù)，以實(shí)現(xiàn)欒樹(shù)的定向改良，使其增強(qiáng)對(duì)Cd的富集能力，從而更有效治理Cd污染。實(shí)驗(yàn)的主要流程如下，其中Hyg^r為潮霉素抗性基因，Kan^r為卡拉霉素抗性基因，請(qǐng)回答：

（1）重組質(zhì)粒的構(gòu)建、擴(kuò)增、保存
①?gòu)募t景天細(xì)胞中提取總RNA為模板，進(jìn)行RTPCR。其中PCR的反應(yīng)條件：98℃10s,55℃30s,72℃1min,35個(gè)循環(huán)，其中55℃30s過(guò)程稱為

復(fù)性

復(fù)性

。若模板雙鏈cDNA的數(shù)量為a個(gè)，經(jīng)過(guò)35個(gè)循環(huán)需要消耗引物的數(shù)量是

2a（2³⁵-1）

2a（2³⁵-1）

。
②為構(gòu)建Cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與綠色熒光蛋白（GFP）的融合蛋白，需確保目的基因與質(zhì)粒正確連接。構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)用

BglⅡ和SpeⅠ

BglⅡ和SpeⅠ

酶切PCR純化產(chǎn)物（已添加相應(yīng)酶切位點(diǎn)）及Ti質(zhì)粒，然后通過(guò)DNA連接酶進(jìn)行連接制備重組質(zhì)粒，并依次轉(zhuǎn)入大腸桿菌和農(nóng)桿菌。
（2）欒樹(shù)愈傷組織的誘導(dǎo)
切割無(wú)菌苗將其莖段插入愈傷組織培養(yǎng)基，培養(yǎng)基應(yīng)添加

細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素

細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素

（填植物激素的名稱），放入培養(yǎng)箱，經(jīng)過(guò)21d的黑暗誘導(dǎo)，莖段經(jīng)

脫分化

脫分化

形成愈傷組織。
（3）農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系的建立
將農(nóng)桿菌單克隆菌株對(duì)欒樹(shù)愈傷組織進(jìn)行侵染轉(zhuǎn)化，并用添加

潮霉素

潮霉素

的培養(yǎng)基篩選出轉(zhuǎn)化成功的愈傷組織，將愈傷組織繼續(xù)培養(yǎng)成完整植株。待幼苗長(zhǎng)出較為發(fā)達(dá)的根系后進(jìn)行移栽煉苗，煉苗的目的是

讓其適應(yīng)野外環(huán)境

讓其適應(yīng)野外環(huán)境

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（4）原生質(zhì)體制備及目的基因的檢測(cè)和鑒定
①取4g篩選后愈傷組織，用鑷子輕輕搗碎，沖洗。用濾網(wǎng)過(guò)濾溶液，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至含

纖維素酶和果膠酶

纖維素酶和果膠酶

的酶解液中處理一段時(shí)間獲得原生質(zhì)體。
②在激光共聚焦下觀測(cè)到細(xì)胞膜發(fā)出綠色熒光。在本研究中選擇GFP與Cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建融合蛋白的目的是

通過(guò)觀察綠色熒光來(lái)確定Cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是否表達(dá)以及分布場(chǎng)所

通過(guò)觀察綠色熒光來(lái)確定Cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是否表達(dá)以及分布場(chǎng)所

。若要從個(gè)體生物學(xué)水平上進(jìn)行目的基因的檢測(cè)與鑒定，則可以檢測(cè)比較轉(zhuǎn)基因欒樹(shù)與野生型欒樹(shù)

Cd的富集能力

Cd的富集能力

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