CD3δ嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（SCID）是由CD3D基因突變引起的，該突變阻止了T細(xì)胞生長發(fā)育所需的CD3D蛋白的合成?？蒲腥藛T對第3代CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行改造，獲得一種超精確的腺嘌呤堿基編輯系統(tǒng)（ABE），該系統(tǒng)主要由向?qū)gRNA、Cas9切口酶和腺嘌呤脫氨酶組成，作用機(jī)制如圖1。利用該系統(tǒng)在CD3δ-SCID患者的造血干細(xì)胞中可以更正約71.2%的致病突變。

（1）研究發(fā)現(xiàn)、Cas9切口酶只能對DNA的單鏈剪切，腺嘌呤脫氨酶催化腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)變成次黃嘌呤核苷酸，次黃嘌呤核苷酸可以和胞嘧啶核苷酸堿基互補(bǔ)配對，據(jù)此推測，至少通過

2

2

次DNA復(fù)制可以完成修復(fù)。
（2）sgRNA是人工合成的一段能與靶基因互補(bǔ)配對的特殊序列，由23個連續(xù)堿基組成。研究發(fā)現(xiàn)，sgRNA會識別與之匹配的其它區(qū)域，導(dǎo)致sgRNA脫靶，試分析其原因是

當(dāng)其他DNA序列也含有與sgRNA互補(bǔ)配對的序列，造成sgRNA錯誤結(jié)合而脫靶

當(dāng)其他DNA序列也含有與sgRNA互補(bǔ)配對的序列，造成sgRNA錯誤結(jié)合而脫靶

，對此，你的解決措施是

適當(dāng)增加sgRNA的長度，提高其與目標(biāo)基因識別的特異性程度

適當(dāng)增加sgRNA的長度，提高其與目標(biāo)基因識別的特異性程度

。
（3）為了對改造后的CD3D基因進(jìn)行研究，把CD3D基因和His標(biāo)簽基因（His標(biāo)簽由6個組氨酸組成）連接起來構(gòu)建融合基因，并構(gòu)建重組基因表達(dá)載體，圖2為載體、CD3D基因的結(jié)構(gòu)、不同限制酶的識別序列及切割位點(diǎn)，欲將標(biāo)簽基因連接在CD3D基因編碼區(qū)的末端，已知組氨酸的密碼子為CAU，終止密碼子為UAG。
①寫出His的基因編碼鏈的堿基序列5'

CATCATCATCATCATCATTAG

CATCATCATCATCATCATTAG

3'。
②為構(gòu)建融合基因并將其插入載體，科研人員設(shè)計(jì)了一對與CD3D基因編碼區(qū)兩端序列互補(bǔ)配對的引物，設(shè)計(jì)時需在引物

B

B

（填“A”或“B”）的5'端增加相應(yīng)的限制酶識別序列和His基因的編碼序列，請寫出該引物開頭的12個堿基序列：5'

CTCGAGCTAATG

CTCGAGCTAATG

3'。