研究發(fā)現(xiàn),TRIM59基因在肝癌細胞中存在異常表達,可用于原發(fā)性肝癌的早期診斷。TRIM59蛋白含有R、B、C和TM四個功能區(qū),如圖1所示;科研人員采用一定的技術(shù)手段,獲得了TRIM59基因的cDNA,分別構(gòu)建TRIM59基因過表達及TRIM59基因敲除質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)染肝癌細胞株后,過表達及敲減細胞株的增殖情況如圖2所示。
(1)圖2的實驗結(jié)果表明
在肝癌細胞系中,敲除TRIM59可以有效抑制細胞的增殖能力,過表達TRIM59細胞的增殖能力顯著增加
在肝癌細胞系中,敲除TRIM59可以有效抑制細胞的增殖能力,過表達TRIM59細胞的增殖能力顯著增加
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(2)科研人員通過PCR擴增了圖1中4種不同長度的蛋白質(zhì)功能區(qū)組合片段所對應(yīng)的TRIM59基因片段,并插入圖3所示的帶FLAG標(biāo)簽序列(27bp)的載體中,與FLAG標(biāo)簽序列形成融合基因。FLAG是一種短肽,使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質(zhì)結(jié)合,但不影響TRIM59蛋白功能區(qū)的功能。
PCR擴增4種不同長度TRIM59基因片段需要的引物有 5
5
種;為了使目的基因正確插入,除△R對應(yīng)的TRIM59基因片段以外,在目的基因上游引物的5′端應(yīng)插入 BamHⅠ
BamHⅠ
(“BamHⅠ”或“EcoRⅠ”)的識別序列,理由是 使用EcoRⅠ會導(dǎo)致載體移碼突變,翻譯出的氨基酸序列改變
使用EcoRⅠ會導(dǎo)致載體移碼突變,翻譯出的氨基酸序列改變
;可利用PCR技術(shù)驗證融合基因是否構(gòu)建成功,其實驗思路是 以插入FLAG-目的基因的載體為模板,使用載體引物F和目的基因下游引物進行PCR擴增,電泳檢測是否擴增出DNA條帶,及對應(yīng)的大小
以插入FLAG-目的基因的載體為模板,使用載體引物F和目的基因下游引物進行PCR擴增,電泳檢測是否擴增出DNA條帶,及對應(yīng)的大小
。
(3)體外實驗發(fā)現(xiàn)TRIM59蛋白和PPM1B蛋白有結(jié)合現(xiàn)象。為了研究兩蛋白在細胞內(nèi)是否結(jié)合,科研人員分別將FLAG-TRIM59(FL)質(zhì)粒、FLAG-TRIM59(R+B)質(zhì)粒、FLAG-TRIM59(R)質(zhì)粒、FLAG-TRIM59(△R)質(zhì)粒與帶有GFP標(biāo)簽的GFP-PPM1B質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染受體細胞,以單獨轉(zhuǎn)染GFP-PPM1B質(zhì)粒的受體細胞作為對照。分別利用FLAG抗體和GFP抗體對①至⑤實驗細胞裂解液中的蛋白質(zhì)進行檢測,結(jié)果如圖4中膠片一、二所示。再利用GFP抗體對上述FLAG抗體免疫沉淀中的蛋白質(zhì)進行檢測,結(jié)果如膠片三所示。
圖中實驗結(jié)果說明 兩蛋白在細胞內(nèi)相互結(jié)合,TRIM59蛋白通過R結(jié)構(gòu)與PPM1B結(jié)合
兩蛋白在細胞內(nèi)相互結(jié)合,TRIM59蛋白通過R結(jié)構(gòu)與PPM1B結(jié)合
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(4)研究發(fā)現(xiàn)TRIM59蛋白的R功能區(qū)具有泛素化連接酶的活性,可介導(dǎo)泛素化途徑降解PPM1B蛋白,PPM1B能夠使某種蛋白去磷酸化進而抑制癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移,據(jù)此可推測肝癌患者中TRIM59蛋白和PPM1B蛋白的量呈 負
負
相關(guān)。