研究發(fā)現(xiàn)，大部分白血病患者細(xì)胞中存在異常的融合基因UBA2-WTIP，可作為檢測(cè)白血病的特異性分子標(biāo)志物?？蒲腥藛T通過(guò)RT-PCR方法克隆得到融合基因UBA2-WTIP，為了研究該基因的作用和致病機(jī)制，需要構(gòu)建重組載體并把目的基因和FLAG標(biāo)簽基因序列連接起來(lái)，分別獲得帶有FLAG肽鏈的UBA2-WTIP融合蛋白和WTIP蛋白。FLAG肽鏈由8個(gè)氨基酸殘基組成，可作為基因工程中蛋白質(zhì)是否表達(dá)的標(biāo)記。
（1）科研人員以提取的某白血病人外周血細(xì)胞總RNA為模板，經(jīng)過(guò)

逆（反）轉(zhuǎn)錄

逆（反）轉(zhuǎn)錄

過(guò)程合成cDNA，設(shè)計(jì)

2

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種引物，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出融合基因UBA2-WTIP.對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，推測(cè)融合基因UBA2-WTIP是在UBA2基因的第16外顯子與WTIP基因的第2外顯子處拼接而成，如圖1所示。為了驗(yàn)證該融合基因的產(chǎn)生是基因組DNA融合而不是不同的RNA剪接后逆轉(zhuǎn)錄所產(chǎn)生的，可通過(guò)PCR驗(yàn)證，其實(shí)驗(yàn)思路和預(yù)期結(jié)果為

提取該病人的DNA，使用圖中F₁和R₁引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若出現(xiàn)239bp擴(kuò)增片段，該融合基因的融合方式是基因組水平融合

提取該病人的DNA，使用圖中F₁和R₁引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若出現(xiàn)239bp擴(kuò)增片段，該融合基因的融合方式是基因組水平融合

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（2）為了構(gòu)建重組載體，科研人員設(shè)計(jì)了以下2種引物，如圖2所示：
上游引物F：為：5'TATGGTACCATG①GCACTGTCGCGGGG3'，GGTACC為KpnⅠ酶切位點(diǎn)；
下游引物R為：5'TAT②TCA③GAGCTCAGTGACGTG3'；
FLAG標(biāo)簽基因編碼鏈序列（5'GATTACAAGGATGACGACGATAAG3'）可以插入目的基因編碼區(qū)的首端或者末端。已知引物中ATG對(duì)應(yīng)起始密碼。若UBA2-WTIP融合基因編碼的蛋白質(zhì)前端有一段信號(hào)肽，則FLAG標(biāo)簽基因序列一般不能插入①位置，原因是

蛋白質(zhì)前端的信號(hào)肽一般會(huì)在蛋白質(zhì)成熟時(shí)被切割掉，所以不能得到帶有FLAG肽鏈的蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)前端的信號(hào)肽一般會(huì)在蛋白質(zhì)成熟時(shí)被切割掉，所以不能得到帶有FLAG肽鏈的蛋白質(zhì)

；若在下游引物R₂②③處插入FLAG標(biāo)簽基因序列和EcoR1酶切位點(diǎn)，已知引物中TCA對(duì)應(yīng)終止密碼，位置③處序列為5'

CTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC

CTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC

3'。
（3）制備的重組載體體外轉(zhuǎn)染人類(lèi)白血病細(xì)胞株KG-la細(xì)胞，提取各組細(xì)胞總蛋白，用FLAG單克隆抗體檢測(cè)蛋白表達(dá)情況，并分別測(cè)定轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的對(duì)照細(xì)胞、轉(zhuǎn)錄UBA2-WTIP融合基因及轉(zhuǎn)錄WTIP基因的KGla細(xì)胞增殖情況，結(jié)果分別如圖3所示。
檢測(cè)相關(guān)蛋白質(zhì)是否表達(dá)的方法是

抗原-抗體雜交

抗原-抗體雜交

；上述生長(zhǎng)曲線(xiàn)結(jié)果說(shuō)明

UBA2-WTIP融合基因能在體外促進(jìn)白血病細(xì)胞增殖，WTIP基因能抑制白血病細(xì)胞的增殖

UBA2-WTIP融合基因能在體外促進(jìn)白血病細(xì)胞增殖，WTIP基因能抑制白血病細(xì)胞的增殖

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