學(xué)習(xí)以下材料，回答（1）～（4）題。
基因魔剪：CRISPR/Cas系統(tǒng)CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)可對(duì)真核細(xì)胞的基因組進(jìn)行特異編輯。CRISPR/Cas9系統(tǒng)由Cas9蛋白和人工設(shè)計(jì)的gRNA構(gòu)成。在gRNA引導(dǎo)下，Cas9與靶序列結(jié)合并將DNA雙鏈切斷（通過(guò)設(shè)計(jì)gRNA中20個(gè)堿基的識(shí)別序列，可人為選擇DNA上的任一目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行切割）。隨后細(xì)胞通過(guò)自身的DNA損傷修復(fù)機(jī)制，將斷裂上下游兩端的序列連接起來(lái)，但通常會(huì)在斷裂處造成少量核苷酸的插入或缺失。當(dāng)DNA雙鏈斷裂后，如果細(xì)胞中有DNA修復(fù)模板（由需要插入的目的基因和靶序列上下游的同源序列組成），斷裂部分可依據(jù)修復(fù)模板進(jìn)行精確修復(fù)，從而將目的基因插入到指定位點(diǎn)（圖1）。
科學(xué)家通過(guò)在Cas9基因中引入突變，獲得了只切割DNA一條鏈的nCas9，并將nCas9與胞嘧啶脫氨酶或腺嘌呤脫氨酶融合，開發(fā)出了單堿基編輯技術(shù)（圖2），能夠?qū)Π形稽c(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)的堿基編輯，最終可以分別實(shí)現(xiàn)C→T（G→A）或A→G（T→C）的堿基替換。對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)改造后，還可用于激活或者抑制基因的轉(zhuǎn)錄等。
目前CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)存在一定的脫靶效應(yīng)：正常情況下，gRNA通過(guò)20個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的引導(dǎo)序列與目標(biāo)DNA序列發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)準(zhǔn)確識(shí)別需要編輯的位點(diǎn)，然而有時(shí)會(huì)發(fā)生第18～20個(gè)堿基不匹配的情況，此時(shí)，Cas9可通過(guò)一個(gè)手指狀的結(jié)構(gòu)緊緊抓住錯(cuò)配區(qū)穩(wěn)定住RNA-DNA雙鏈，從而為Cas9切割DNA鋪平道路，但這可能會(huì)導(dǎo)致Cas9在錯(cuò)誤的基因位點(diǎn)切割雙鏈DNA，從而引發(fā)潛在風(fēng)險(xiǎn)。
盡管如此，CRISPR/Cas系統(tǒng)作為一種革命性的技術(shù)，其成本低、制作簡(jiǎn)便、快捷高效等優(yōu)點(diǎn)讓它迅速風(fēng)靡于世界各地的實(shí)驗(yàn)室，成為科研、醫(yī)療等領(lǐng)域的有效工具。
（1）利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯，需構(gòu)建含gRNA基因和Cas9基因的 基因表達(dá)載體（或重組DNA分子、重組質(zhì)粒）基因表達(dá)載體（或重組DNA分子、重組質(zhì)粒），并導(dǎo)入受體細(xì)胞。Cas9蛋白與 限制限制酶的功能相似。gRNA依據(jù) 堿基互補(bǔ)配對(duì)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與靶序列特異性結(jié)合，引導(dǎo)Cas9蛋白進(jìn)行切割。
（2）若用CRISPR/Cas9系統(tǒng)將某一基因從基因組序列中刪除，需要設(shè)計(jì)2個(gè)gRNA，使其分別與 靶基因兩端靶基因兩端的序列互補(bǔ)。有些遺傳病是由于基因中一個(gè)堿基對(duì)改變引起的，若要修正此基因突變，文中圖示的3種途徑中，③③（填“①”“②”或“③”）更為合適。
（3）研究者通過(guò)一些技術(shù)讓Cas9基因發(fā)生突變，使Cas9蛋白失去切割活性，可將CRISPR/Cas9用于抑制基因轉(zhuǎn)錄，實(shí)施的過(guò)程為：在gRNA的引導(dǎo)下，Cas9蛋白與靶基因的 啟動(dòng)子啟動(dòng)子結(jié)合，使 RNA聚合酶RNA聚合酶失去結(jié)合位點(diǎn)從而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。
（4）請(qǐng)結(jié)合文章，提出降低CRISPR/Cas9系統(tǒng)脫靶效應(yīng)的思路。設(shè)計(jì)gRNA的長(zhǎng)度為17個(gè)堿基，避免第18～20個(gè)堿基不匹配時(shí)，導(dǎo)致錯(cuò)誤位點(diǎn)的切割（或設(shè)計(jì)出特異性較強(qiáng)的gRNA，增強(qiáng)gRNA的特異性；通過(guò)設(shè)計(jì)Cas9，讓其手指狀結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)離DNA序列，從而在gRNA與DNA錯(cuò)配時(shí)，不會(huì)穩(wěn)定錯(cuò)配結(jié)構(gòu)，避免在錯(cuò)誤位點(diǎn)切割等）設(shè)計(jì)gRNA的長(zhǎng)度為17個(gè)堿基，避免第18～20個(gè)堿基不匹配時(shí)，導(dǎo)致錯(cuò)誤位點(diǎn)的切割（或設(shè)計(jì)出特異性較強(qiáng)的gRNA，增強(qiáng)gRNA的特異性；通過(guò)設(shè)計(jì)Cas9，讓其手指狀結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)離DNA序列，從而在gRNA與DNA錯(cuò)配時(shí)，不會(huì)穩(wěn)定錯(cuò)配結(jié)構(gòu)，避免在錯(cuò)誤位點(diǎn)切割等）。
【考點(diǎn)】基因工程在農(nóng)牧、醫(yī)療、食品等方面的應(yīng)用．
【答案】基因表達(dá)載體（或重組DNA分子、重組質(zhì)粒）；限制；堿基互補(bǔ)配對(duì)；靶基因兩端；③；啟動(dòng)子；RNA聚合酶；設(shè)計(jì)gRNA的長(zhǎng)度為17個(gè)堿基，避免第18～20個(gè)堿基不匹配時(shí)，導(dǎo)致錯(cuò)誤位點(diǎn)的切割（或設(shè)計(jì)出特異性較強(qiáng)的gRNA，增強(qiáng)gRNA的特異性；通過(guò)設(shè)計(jì)Cas9，讓其手指狀結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)離DNA序列，從而在gRNA與DNA錯(cuò)配時(shí)，不會(huì)穩(wěn)定錯(cuò)配結(jié)構(gòu)，避免在錯(cuò)誤位點(diǎn)切割等）
【解答】
【點(diǎn)評(píng)】
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發(fā)布：2024/6/14 8:0:9組卷：23引用：1難度：0.5
相似題
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1．學(xué)習(xí)以下材料，回答（1）～（4）題。
利用抑制性tRNA進(jìn)行無(wú)義突變遺傳病的治療
無(wú)義突變是由于某個(gè)堿基的改變使代表某種氨基酸的密碼子突變?yōu)榻K止密碼子（UAA、UAG或UGA），從而使肽鏈合成提前終止，造成蛋白質(zhì)的功能改變，引發(fā)相關(guān)疾病。約有10%～15%的人類基因相關(guān)遺傳疾病是由無(wú)義突變引發(fā)的。常規(guī)的基因治療是將正?；虻腸DNA序列或是有治療價(jià)值的基因（如CRISPR-Cas9相關(guān)的基因編輯工具）通過(guò)一定的方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞內(nèi)，達(dá)到替代或修復(fù)缺陷基因、治療疾病的目的。導(dǎo)入基因插入位置不當(dāng)、過(guò)高或過(guò)低表達(dá)，都可能會(huì)導(dǎo)致副作用。盡管基因編輯可以實(shí)現(xiàn)生理水平的基因表達(dá)，但基因編輯工具引入外源蛋白可能引發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)仍然是巨大的挑戰(zhàn)。
抑制性tRNA（sup-tRNA）由天然tRNA改造而來(lái)，它的反密碼子通過(guò)堿基配對(duì)原則可以識(shí)別無(wú)義突變的終止密碼子，使得mRNA在翻譯至無(wú)義突變位點(diǎn)時(shí)不啟動(dòng)翻譯終止而是繼續(xù)向后進(jìn)行翻譯，獲得有功能的全長(zhǎng)蛋白。
I型黏多糖貯積癥的病因，是相關(guān)基因發(fā)生無(wú)義突變，產(chǎn)生終止密碼子UAG。研究者構(gòu)建小鼠該突變基因mldua和Flag基因融合的載體（圖1），以及針對(duì)該無(wú)義突變?cè)O(shè)計(jì)的sup-tRNA表達(dá)載體（產(chǎn)生的sup-tRNA能夠識(shí)別UAG并攜帶酪氨酸Tyr,簡(jiǎn)寫作sup-tRNATyr），將其導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與具有相似作用的化合物G418比較，sup--tRNA的作用更加顯著（圖2）；進(jìn)一步利用重組腺相關(guān)病毒作為載體將sup-tRNA導(dǎo)入患病小鼠模型中，實(shí)驗(yàn)顯示能夠降低黏多糖過(guò)度積存，實(shí)現(xiàn)對(duì)該病癥的有效治療，其療效可以持續(xù)半年以上。
從整體來(lái)看，G418在促進(jìn)跨越無(wú)義突變位點(diǎn)繼續(xù)翻譯時(shí)引入的氨基酸較為隨機(jī)，而sup-tRNA引入的氨基酸較為單一，且不會(huì)影響內(nèi)源tRNA穩(wěn)態(tài)，所以sup-tRNA在個(gè)體治療中具有很高的安全性，因而在未來(lái)基因突變引起的疾病相關(guān)治療中具有非常大的應(yīng)用前景。
（1）侵染時(shí)，作為載體的重組腺相關(guān)病毒與靶細(xì)胞膜上的發(fā)生識(shí)別，引發(fā)內(nèi)吞，進(jìn)入細(xì)胞后釋放單鏈DNA作為模板，利用宿主細(xì)胞的催化合成其互補(bǔ)DNA鏈，再經(jīng)過(guò)過(guò)程產(chǎn)生sup-tRNA。
（2）除了引入的氨基酸較為單一，不影響內(nèi)源tRNA穩(wěn)態(tài)，我們還可推斷，用于治療的sup-tRNA在正常終止密碼子處（填“能”或“不能”）繼續(xù)往后翻譯，具有很高的安全性。
（3）研究者構(gòu)建mldua突變基因和Flag基因融合的載體，目的是通過(guò)檢測(cè)來(lái)確定是否跨越無(wú)義突變位點(diǎn)繼續(xù)向后翻譯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相比于化合物G418，sup-tRNA在促進(jìn)無(wú)義突變位點(diǎn)的翻譯方面更加有效，支持這一結(jié)論的依據(jù)是：。
（4）有文獻(xiàn)報(bào)道，已在近1000個(gè)不同的人類基因中發(fā)現(xiàn)了7500多個(gè)無(wú)義突變。常規(guī)的基因治療需要為每種疾病設(shè)計(jì)獨(dú)特的治療策略，這將是一項(xiàng)耗費(fèi)驚人的項(xiàng)目。據(jù)此說(shuō)明sup-tRNA的應(yīng)用價(jià)值。發(fā)布：2025/1/3 8:0:1組卷：27引用：1難度：0.6 -
2．人類基因組計(jì)劃測(cè)定了人體的24條染色體，這24條染色體是（ ?。?/h2>
發(fā)布：2024/12/31 0:30:1組卷：112引用：7難度：0.7 -
3．幾丁質(zhì)是許多真菌細(xì)胞壁的重要成分，自然界有些植物能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶催化幾丁質(zhì)水解從而抵抗真菌感染。通過(guò)基因工程將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入沒(méi)有抗性的植物體內(nèi)，可增強(qiáng)其抗真菌的能力。如圖表示為獲取幾丁質(zhì)酶基因而建立cDNA文庫(kù)的過(guò)程。
（1）圖示以mRNA為材料通過(guò)法獲得cDNA，該方法依據(jù)的原理是，通過(guò)這種方法獲得的基因中因缺乏和結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致將其直接導(dǎo)入受體細(xì)胞中不能復(fù)制和表達(dá)。
（2）與選用老葉相比，選用嫩葉更容易提取到mRNA，原因是，且提取RNA時(shí)，提取液中需添加RNA酶抑制劑，其目的是。
（3）將從cDNA文庫(kù)中獲得的幾丁質(zhì)酶基因和質(zhì)粒載體用酶和DNA連接處理后連接起來(lái)，構(gòu)建基因表達(dá)載體，DNA連接酶催化形成的化學(xué)鍵是。發(fā)布：2025/1/5 8:0:1組卷：5引用：1難度：0.7
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