人胰島素基因表達的最初產物是一條肽鏈構成的胰島素原，切除部分肽段（C肽段）后形成成熟的胰島素，如圖1所示?？茖W家據(jù)此提出了利用基因工程改造的大腸桿菌生產人胰島素的兩種方法：AB法是根據(jù)胰島素A、B兩條肽鏈的氨基酸序列人工合成兩種DNA片段，利用工程菌分別合成兩條肽鏈后將其混合自然形成胰島素；BCA法是利用胰島B細胞中的mRNA得到胰島素基因，表達出胰島素原后再用特定酶切掉C肽段。這兩種方法使用同一種質粒作為載體。利用基因工程生產人胰島素的關鍵步驟是目的基因的獲取和表達載體的構建。

（1）由于密碼子具有

簡并

簡并

性，AB法中人工合成的兩種DNA片段均有多種可能的序列。獲取的目的基因中不含人胰島素基因啟動子的方法是

AB和BCA

AB和BCA

（填“AB”或“BCA”或“AB和BCA”）法。
（2）為使圖2中載體能連接目的基因形成表達載體，可在待擴增的目的基因片段兩端加上特定的酶切位點，用于后續(xù)的酶切和連接反應。又有研究表明大多數(shù)限制酶對裸露的酶切位點不能切斷，必須在酶切位點旁邊加上一個至幾個保護堿基。根據(jù)上述信息，在設計PCR引物時可添加限制酶

XhoⅠ和MunⅠ

XhoⅠ和MunⅠ

的識別序列。保護堿基序列應添加在限制酶識別序列的

5'

5'

（填“3'”或“5'”）端。從以下序列中選擇出適合的上游引物（GGG是保護堿基序列）：

c

c

。
a：5'-GTAGTCGAACAATTGGGG-3'e：5'-CTCGAGGGGATGCCAATC-3'
b：5'-CAATTGGGGGTAGTCGAA-3'f：5'-GGGCAATTGGTAGTCGAA-3'
c：5'-GGGCTCGAGATGCCAATC-3'g：5'-ATGCCAATCGGGCTCGAG-3'
d：5'-ATGCCAATCCTCGAGGGG-3'h：5'-GTAGTCGAAGGGCAATTG-3
（3）β-半乳糖苷酶可以分解無色的X-gal產生藍色物質。篩選導入重組質粒的大腸桿菌時，在添加了氨芐青霉素和X-gal的培養(yǎng)基上應選擇白色的菌落，原因是

因為目的基因的插入破壞了lacZ基因的結構，使其不能正常表達產生β-半乳糖苷酶，底物X-gal不會被分解（未導入質粒的大腸桿菌無法在添加了氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長）

因為目的基因的插入破壞了lacZ基因的結構，使其不能正常表達產生β-半乳糖苷酶，底物X-gal不會被分解（未導入質粒的大腸桿菌無法在添加了氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長）

。
（4）經(jīng)測算BCA法的成本顯著低于AB法，根據(jù)這兩種方法的差異分析可能的原因是

①人工合成目的基因的成本高于反轉錄PCR合成目的基因；②利用工程菌表達兩條肽鏈的成本高于表達一條肽鏈；③兩條肽鏈連接形成胰島素的效率低于一條肽鏈酶切形成胰島素的效率

①人工合成目的基因的成本高于反轉錄PCR合成目的基因；②利用工程菌表達兩條肽鏈的成本高于表達一條肽鏈；③兩條肽鏈連接形成胰島素的效率低于一條肽鏈酶切形成胰島素的效率

（答1點即可）。