研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)體腫瘤內(nèi)部通常是缺氧的環(huán)境，蓖麻毒素蛋白（RTA）可作用于核糖體，使蛋白合成受阻，從而引起細(xì)胞死亡。TAT是一種短肽，可轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白進(jìn)入細(xì)胞，含有氧依賴性降解區(qū)域ODD（多肽）的融合蛋白可以適應(yīng)低氧條件穩(wěn)定存在，但在常氧條件下會(huì)被蛋白酶降解?？蒲腥藛T以RTA作為抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性分子，利用TAT的作用將融合蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，并利用ODD的作用減輕RTA對(duì)正常細(xì)胞的毒性，分別構(gòu)建了含TAT-RTA（660bp）和TAT-RTA-ODD（870bp）融合基因的表達(dá)載體，并成功得到相關(guān)融合蛋白。
（1）可采用PCR的方法獲取融合基因TAT-RTA，需要根據(jù)TAT和RTA基因設(shè)計(jì)引物，引物的作用是

與模板DNA單鏈互補(bǔ)配對(duì)實(shí)現(xiàn)連接，并且使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸

與模板DNA單鏈互補(bǔ)配對(duì)實(shí)現(xiàn)連接，并且使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸

。已知RTA基因和欲得到的TAT-RTA融合基因的結(jié)構(gòu)如圖1所示，TAT基因編碼鏈序列5'ATGAGCTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGA3′，為順利構(gòu)建表達(dá)載體，需要在引物1的5′端加入

BamHⅠ

BamHⅠ

酶切位點(diǎn)，引物2的5′端加入

XboⅠ

XboⅠ

酶切位點(diǎn)，利用TAT和RTA核酸序列設(shè)計(jì)引物時(shí)，要求在RTA蛋白的前端引入TAT短肽，請(qǐng)根據(jù)要求寫出引物1

5'GGATCCATGAGC3'

5'GGATCCATGAGC3'

（寫出引物5′端的12個(gè)堿基即可）。

（2）載體的部分結(jié)構(gòu)如圖2所示，His標(biāo)簽由連續(xù)的6個(gè)組氨酸構(gòu)成，可用于對(duì)重組融合蛋白進(jìn)行分離純化，將PCR得到的TAT-RTA融合基因和載體雙酶切后，再用

DNA連接

DNA連接

酶連接。但是在研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)融合蛋白中沒(méi)有His標(biāo)簽蛋白，據(jù)圖分析原因是

限制酶2識(shí)別序列后面的一個(gè)堿基A與His標(biāo)簽基因編碼鏈的前兩個(gè)堿基CA編碼一個(gè)氨基酸，導(dǎo)致His標(biāo)簽基因?qū)?yīng)的mRNA的密碼子被錯(cuò)位讀取

限制酶2識(shí)別序列后面的一個(gè)堿基A與His標(biāo)簽基因編碼鏈的前兩個(gè)堿基CA編碼一個(gè)氨基酸，導(dǎo)致His標(biāo)簽基因?qū)?yīng)的mRNA的密碼子被錯(cuò)位讀取

。可通過(guò)引物2的特殊設(shè)計(jì)使His標(biāo)簽正常表達(dá)，請(qǐng)結(jié)合圖1和圖2寫出引物2

5'CTCGAGTAGAACTGGCTGCTCGGCGG3'

5'CTCGAGTAGAACTGGCTGCTCGGCGG3'

（引物中如需添加堿基補(bǔ)足對(duì)應(yīng)的密碼子，可以添加任意堿基）。
（3）科研人員將得到的重組融合蛋白經(jīng)腹腔給藥荷瘤小鼠（患實(shí)體腫瘤的小鼠稱為荷瘤小鼠），研究荷瘤小鼠腫瘤體積變化，結(jié)果如圖3所示，
請(qǐng)寫出本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

TAT-RTA和TAT-RTA-ODD融合蛋白都可以抑制荷瘤小鼠腫瘤體積的增長(zhǎng)，TAT-RTA-ODD融合蛋白的抑制效果更好

TAT-RTA和TAT-RTA-ODD融合蛋白都可以抑制荷瘤小鼠腫瘤體積的增長(zhǎng)，TAT-RTA-ODD融合蛋白的抑制效果更好

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產(chǎn)生該實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因是

含有氧依賴性降解區(qū)域ODD（多肽）的融合蛋白可以適應(yīng)腫瘤內(nèi)部低氧條件穩(wěn)定存在，從而更好地抑制腫瘤體積增長(zhǎng)

含有氧依賴性降解區(qū)域ODD（多肽）的融合蛋白可以適應(yīng)腫瘤內(nèi)部低氧條件穩(wěn)定存在，從而更好地抑制腫瘤體積增長(zhǎng)

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