M蛋白（由M基因編碼）是一類廣泛存在于動植物中的金屬結(jié)合蛋白，具有吸附重金屬的作用，M基因能在大腸桿菌和動物A的肝細(xì)胞中特異性表達(dá)?，F(xiàn)設(shè)計實驗如下：
1實驗一：科研人員將外源DNA片段F插入M基因的特定位置，再通過一定的技術(shù)手段獲得M基因失活的轉(zhuǎn)基因克隆動物A，流程如圖1所示。
2實驗二：將M基因?qū)氪竽c桿菌構(gòu)建具有吸附重金屬的作用的工程菌，如圖2所示。
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（1）在構(gòu)建含有片段F的重組質(zhì)粒過程中，用于切割質(zhì)粒DNA的工具酶能將特定部位的兩個核苷酸之間的

磷酸二酯鍵

磷酸二酯鍵

斷開。
（2）在進(jìn)行動物A成纖維細(xì)胞培養(yǎng)時，需要定期更換培養(yǎng)液，目的是

清除代謝產(chǎn)物，防止細(xì)胞代謝產(chǎn)物積累對細(xì)胞自身造成危害（同時給細(xì)胞提供足夠的營養(yǎng)）

清除代謝產(chǎn)物，防止細(xì)胞代謝產(chǎn)物積累對細(xì)胞自身造成危害（同時給細(xì)胞提供足夠的營養(yǎng)）

。
（3）鑒定轉(zhuǎn)基因動物：通過動物細(xì)胞融合等技術(shù)制備M蛋白的單克隆抗體，簡要寫出利用此抗體確定克隆動物A中M基因是否失活的實驗思路。

取動物A和克隆動物A的肝組織細(xì)胞，分別提取蛋白質(zhì)進(jìn)行抗原—抗體雜交

取動物A和克隆動物A的肝組織細(xì)胞，分別提取蛋白質(zhì)進(jìn)行抗原—抗體雜交

。
（4）根據(jù)M蛋白cDNA的核苷酸序列設(shè)計了相應(yīng)的引物（圖2甲），通過PCR擴(kuò)增M基因。已知A位點和B位點分別是起始密碼子和終止密碼子對應(yīng)的基因位置。選用的引物組合應(yīng)為

引物a和引物d

引物a和引物d

。實驗二中，PCR所用的DNA聚合酶擴(kuò)增出的M基因的末端為平末端。由于載體E只有能產(chǎn)生黏性末端的酶切位點，需借助中間載體P將M基因接入載體E。載體P和載體E的酶切位點及相應(yīng)的酶切序列如圖2乙所示。
①選用

EcoRV

EcoRV

酶將載體P切開，再用

T4

T4

DNA連接酶將M基因與載體P相連，構(gòu)成重組載體P′。
②由于載體P'不具有表達(dá)M基因的

啟動子和終止子

啟動子和終止子

故應(yīng)該選用

XhoⅠ和PstⅠ

XhoⅠ和PstⅠ

酶組合對載體P'和載體E進(jìn)行酶切，將切下的M基因和載體E用DNA連接酶進(jìn)行連接，將得到的混合物導(dǎo)入到用

Ca²⁺

Ca²⁺

處理的大腸桿菌，篩出M工程菌。
（5）M基因在工程菌的表達(dá)量如圖3所示。請回答該結(jié)果能否說明已經(jīng)成功構(gòu)建了具有較強(qiáng)吸附廢水中重金屬能力的工程菌的理由并說明原因？

不能

不能

，

因為尚未在個體生物學(xué)水平上對M工程菌吸附重金屬的能力進(jìn)行鑒定

因為尚未在個體生物學(xué)水平上對M工程菌吸附重金屬的能力進(jìn)行鑒定

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