Leber遺傳性視神經(jīng)病是一種嚴(yán)重的遺傳病，患者線粒體內(nèi)的ND4基因發(fā)生突變，患病基因由母親傳給孩子。目前常用“三親嬰兒”的方法幫助女性患者生下健康嬰兒?！叭H嬰兒”需取志愿者的去核卵細(xì)胞作為細(xì)胞質(zhì)的來源，構(gòu)建健康受精卵的流程簡圖如圖1。回答下列問題：
?
（1）“三親嬰兒”的誕生需依次用到核移植、

體外受精

體外受精

、胚胎體外培養(yǎng)和

胚胎移植

胚胎移植

等技術(shù)，屬于有性生殖。該過程不能直接用女方的體細(xì)胞作為核供體的原因是

體細(xì)胞中含2套染色體組

體細(xì)胞中含2套染色體組

。
（2）某研究小組欲克隆ND4基因并研究其表達(dá)的蛋白，選用了下圖所示的質(zhì)粒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。利用PCR擴(kuò)增基因時(shí)，應(yīng)當(dāng)挑選的引物是

引物2和3

引物2和3

（從圖2引物中挑選）。為使目的基因的PCR產(chǎn)物能被限制酶切割，可通過引物使得PCR產(chǎn)物兩端帶上限制酶酶切位點(diǎn)，據(jù)圖判斷，質(zhì)粒上所示的限制酶酶切位點(diǎn)中不能挑選的是哪幾個(gè)？

BCD

BCD

（A．BamHⅠB．XhoⅠC．HindⅢD．XbaⅠ）。
（3）獲得重組質(zhì)粒后，可將其導(dǎo)入經(jīng)

Ca²⁺

Ca²⁺

處理過的大腸桿菌。除了用四環(huán)素篩選外，還可通過

PCR

PCR

技術(shù)確認(rèn)大腸桿菌中是否轉(zhuǎn)入了ND4基因。
（4）為使ND4基因在大腸桿菌內(nèi)高效表達(dá)，所用啟動(dòng)子應(yīng)選擇

細(xì)菌

細(xì)菌

（填“細(xì)菌”或“真核細(xì)胞”）的，這樣有利于大腸桿菌的RNA聚合酶與之結(jié)合。用

液體

液體

培養(yǎng)基對(duì)含ND4基因的大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，合成ND4蛋白。已知ND4蛋白為胞內(nèi)蛋白，若要提取ND4蛋白，需對(duì)擴(kuò)大培養(yǎng)的菌體進(jìn)行

離心（沉淀、過濾）

離心（沉淀、過濾）

操作，并進(jìn)一步破碎細(xì)胞以分離提純ND4蛋白。為探究ND4蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布，需制備針對(duì)ND4蛋白的

單克隆抗體

單克隆抗體

。
（5）實(shí)驗(yàn)完成后，剩余細(xì)菌、使用過的培養(yǎng)基等均需經(jīng)

高壓蒸汽滅菌

高壓蒸汽滅菌

處理再統(tǒng)一廢棄，原因是

防止微生物污染環(huán)境

防止微生物污染環(huán)境

。