利用枯草芽孢桿菌的發(fā)酵可以生產(chǎn)亮氨酸脫氫酶。在啟動(dòng)子和亮氨酸脫氫酶基因之間插入信號(hào)肽（SPY）基因并將重組質(zhì)粒導(dǎo)入枯草芽孢桿菌構(gòu)建工程菌，可提高亮氨酸脫氫酶的生產(chǎn)水平。重組質(zhì)粒的構(gòu)建如圖所示，Kan^R為卡那霉素抗性基因，Amp^R為氨芐青霉素抗性基因，圖中各限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端不同?；卮鹣铝袉栴}：
（1）該基因表達(dá)載體中除圖中標(biāo)注外，還應(yīng)具有終止子、復(fù)制原點(diǎn)等結(jié)構(gòu)。啟動(dòng)子是

RNA聚合酶

RNA聚合酶

識(shí)別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。Kan^R和Amp^R都為抗生素抗性基因，其作用是

便于重組DNA分子的篩選

便于重組DNA分子的篩選

。
（2）在構(gòu)建該基因表達(dá)載體的過程中，為提高重組率及避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化以及目的基因和質(zhì)粒反向連接，具體操作是

使用限制酶NdeⅠ和BamHⅠ切割目的基因和質(zhì)粒，再利用DNA連接酶拼接成重組DNA分子

使用限制酶NdeⅠ和BamHⅠ切割目的基因和質(zhì)粒，再利用DNA連接酶拼接成重組DNA分子

。
（3）可利用

PCR

PCR

反應(yīng)體系擴(kuò)增亮氨酸脫氫酶基因，該反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中才能進(jìn)行，其過程包括

變性

變性

、復(fù)性和延伸三步，其中延伸階段需加入耐高溫的DNA聚合酶，其作用是

催化合成DNA子鏈

催化合成DNA子鏈

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（4）將重組質(zhì)粒導(dǎo)入枯草芽孢桿菌構(gòu)建工程菌時(shí)，一般先用Ca²⁺處理枯草芽孢桿菌，目的是

使枯草芽孢桿菌處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)

使枯草芽孢桿菌處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)

。利用枯草芽孢桿菌在發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)亮氨酸脫氫酶時(shí)，要隨時(shí)檢測(cè)培養(yǎng)液中的

微生物的數(shù)量、產(chǎn)物的濃度

微生物的數(shù)量、產(chǎn)物的濃度

（答兩點(diǎn)）等，以了解發(fā)酵進(jìn)程，還要及時(shí)添加必需的營(yíng)養(yǎng)組分，嚴(yán)格控制溫度、pH和溶解氧等發(fā)酵條件。