基因敲減主要是指從轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平使基因表達失活的技術(shù)，其中RNA干擾技術(shù)是常用的基因敲減技術(shù)，該技術(shù)首先要根據(jù)目的基因序列設(shè)計出反義RNA和正義RNA構(gòu)建成雙鏈RNA（shRNA），然后用相關(guān)酶切割shRNA形成反義RNA片段，其可與目的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA堿基互補配對，進而誘導(dǎo)相關(guān)酶水解mRNA，實現(xiàn)對基因的敲減。為檢測設(shè)計出的shRNA是否能成功敲減基因還需要利用熒光酶報道基因系統(tǒng)進行驗證。如圖1表示敲減載體構(gòu)建，圖2表示熒光酶報道基因系統(tǒng)檢測的原理。

（1）據(jù)圖1分析，若要從含shRNA基因的DNA分子中擴增出shRNA基因并能使其在受體細胞中表達，需要用到的引物是

引物2、引物5

引物2、引物5

，為使擴增出的shRNA基因能夠和質(zhì)粒構(gòu)建敲減載體，在設(shè)計引物時需在引物的

5'

5'

（填5'或3'）端分別添加

BamHⅠ、HindⅢ

BamHⅠ、HindⅢ

酶能夠識別的序列。
（2）已知mRNA末端缺失會導(dǎo)致mRNA水解。熒光酶報道基因與欲敲減的目的基因串聯(lián)可構(gòu)成熒光酶報道基因系統(tǒng)，熒光酶報道基因與目的基因的連接點是終止密碼子對應(yīng)的序列，而不是終止子，其原因是

轉(zhuǎn)錄過程在終止子處會終止，若連接點為終止密碼子對應(yīng)的序列則不能實現(xiàn)兩基因的mRNA的串聯(lián)

轉(zhuǎn)錄過程在終止子處會終止，若連接點為終止密碼子對應(yīng)的序列則不能實現(xiàn)兩基因的mRNA的串聯(lián)

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（3）熒光酶報道基因系統(tǒng)與敲減載體一同導(dǎo)入受體細胞中可以根據(jù)熒光的有無檢測敲減載體是否成功，其機理是

若敲減載體能夠敲除目的基因，則熒光酶報道基因和目的基因轉(zhuǎn)錄形成的mRNA會被水解，熒光酶報道基因不能正常表達，無法檢測到熒光出現(xiàn)

若敲減載體能夠敲除目的基因，則熒光酶報道基因和目的基因轉(zhuǎn)錄形成的mRNA會被水解，熒光酶報道基因不能正常表達，無法檢測到熒光出現(xiàn)

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