研究者將釀酒酵母S288c的APAl基因與EGFP（增強型綠色熒光蛋白）基因構成融合基因，并進一步構建表達載體（如圖甲所示）。以該載體為模板，再通過PCR介導的定點突變技術向APAl基因中分別引入突變位點，經(jīng)典的大引物PCR定點誘變技術成為基于PCR技術的定點誘變技術中應用最普遍的方法，操作過程如圖乙所示，其中引物箭頭代表子鏈延伸方向?；卮鹣铝袉栴}：
（1）構建表達載體時，應將融合基因放于
啟動子
啟動子
、終止子
終止子
等結構之間，以保證目的基因的轉錄。為實現(xiàn)質粒和融合基因的高效連接，切割質粒時選用限制酶XmaⅠ而不選用限制酶SmaⅠ的原因是 SmaI的酶切末端為平末端，無法與融合基因上的黏性末端連接
SmaI的酶切末端為平末端，無法與融合基因上的黏性末端連接
。為將融合基因構建在質粒上，還需要 BglII、DNA連接酶
BglII、DNA連接酶
等酶。
（2）利用大引物PCR進行定點誘變需要進行兩輪PCR（PCR1和PCR2）。在PCR1中，至少需要 2
2
個循環(huán)才能獲得相應的大引物模板。在PCR2中？處的引物應選用大引物兩條鏈中的 ②
②
（填“①”或“②”）鏈的子鏈。
（3）若在熒光顯微鏡下觀察到受體細胞有綠色熒光，則表明 APAl基因與EGFP基因已經(jīng)表達（或融合基因形成了蛋白質產物）
APAl基因與EGFP基因已經(jīng)表達（或融合基因形成了蛋白質產物）
，EGFP基因的作用是 作為標記基因，用于目的基因的檢測和鑒定
作為標記基因，用于目的基因的檢測和鑒定
。
