基因工程自20世紀(jì)70年代興起后，在短短的30年間，得到了飛速的發(fā)展，目前已成為生物科學(xué)的核心技術(shù)?；蚬こ痰幕静僮鞒绦蛑饕ㄋ膫€步驟：
（1）目的基因的獲?。?br />①如果目的基因的核苷酸序列是已知的，可用

化學(xué)合成法

化學(xué)合成法

合成目的基因，或者用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因；
②如果目的基因的核苷酸序列是未知的，可以建立一個包括該種生物所有基因的基因組文庫，或者通過

逆轉(zhuǎn)錄

逆轉(zhuǎn)錄

方法建立cDNA文庫。
（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：
①對于遺傳背景未知的生物，可提取該生物的基因組DNA，用多種

限制

限制

酶切割成各種不同DNA片段，分別導(dǎo)入大腸桿菌（如圖所示）。由于切割后的基因片段大小不一，有的片段可能含有多個基因，不宜直接導(dǎo)入表達(dá)載體，所以可以先將它們分別與克隆質(zhì)粒（如PBR322）連接構(gòu)建重組載體，利用加入

氨芐青霉素

氨芐青霉素

的培養(yǎng)基篩選得到多個大腸桿菌菌落，不同的菌落中含有

相同或不同

相同或不同

（“相同”、“不同”、“相同或不同”）的基因。將轉(zhuǎn)移到纖維素膜上的細(xì)菌裂解，釋放出DNA，利用分子雜交技術(shù)檢測目的基因，依據(jù)圖示雜交帶，可進(jìn)一步選取

b

b

菌落（填寫圖中字母）繼續(xù)培養(yǎng)，從而獲得含有目的基因的受體菌。再將獲得的目的基因與相應(yīng)的質(zhì)粒（如pET）連接構(gòu)建表達(dá)載體，pET質(zhì)粒含有卡那霉素抗性基因、復(fù)制原點(diǎn)外，還必須有

啟動子和終止子

啟動子和終止子

，以利于DNA片段在受體細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。
②與上述方法相比，通過cDNA文庫獲取的目的基因，可直接與pET質(zhì)粒連接構(gòu)建表達(dá)載體，理由是

cDNA片段較小

cDNA片段較小

。

（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：
如果目的基因來自真核細(xì)胞的基因組DNA序列，轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞一般不能為大腸桿菌，若目的基因來自cDNA文庫，則受體細(xì)胞可不受限制，原因是

cDNA序列無內(nèi)含子，真核細(xì)胞基因序列中含有內(nèi)含子，大腸桿菌等原核細(xì)胞無法對內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄片段進(jìn)行剪切修飾

cDNA序列無內(nèi)含子，真核細(xì)胞基因序列中含有內(nèi)含子，大腸桿菌等原核細(xì)胞無法對內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄片段進(jìn)行剪切修飾

。
（4）目的基因的檢測與鑒定：
導(dǎo)入受體細(xì)胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性，需要通過分子水平檢測和個體生物學(xué)水平鑒定。