如圖是將乙肝病毒表面主蛋白基因HBsAg導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母菌生產(chǎn)乙肝疫苗的過程示意圖。巴斯德畢赤酵母菌是一種甲基營養(yǎng)型酵母，能將甲醇作為其唯一碳源，此時(shí)AOX1基因受到誘導(dǎo)而表達(dá)，圖中pPIC9K質(zhì)粒上5′AOX1和3′AOX1（TT）分別是基因AOX1的啟動(dòng)子和終止子。該酵母菌體內(nèi)無天然質(zhì)粒，科學(xué)家改造出了圖1所示質(zhì)粒用作載體，其與目的基因形成的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后可以與酵母菌染色體發(fā)生同源重組，將目的基因整合于染色體中以實(shí)現(xiàn)表達(dá)。請(qǐng)回答：
（1）用PCR技術(shù)擴(kuò)增HBsAg基因時(shí)原料是
脫氧核苷酸（dNTP）
脫氧核苷酸（dNTP）
，Taq酶需要 Mg2+
Mg2+
激活。
（2）為實(shí)現(xiàn)HBsAg基因和pPIC9K質(zhì)粒重組，設(shè)計(jì)引物時(shí)需要在引物的 5’
5’
端添加相應(yīng)限制酶的識(shí)別序列，則在HBsAg基因兩側(cè)的A和B位置添加的堿基序列分別是 TACGTA
TACGTA
、CCTAGG
CCTAGG
，這樣設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)是 避免目的基因反向接入質(zhì)粒（保證目的基因定向接入質(zhì)粒）
避免目的基因反向接入質(zhì)粒（保證目的基因定向接入質(zhì)粒）
。
（3）酶切獲取HBsAg基因后，需用 T4DNA連接酶
T4DNA連接酶
（填“E.coliDNA連接酶”或“T4DNA連接酶”）將其連接到pPIC9K質(zhì)粒上，形成重組質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒的目的是 讓目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在和遺傳，并使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用
讓目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在和遺傳，并使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用
。
（4）若用限制酶SnaBⅠ、BglⅡ聯(lián)合酶切pPIC9K質(zhì)粒，獲得的DNA片段的長度分別是38kb、27kb、67kb；用限制酶BglⅡ、AvrⅡ聯(lián)合酶切pPIC9K質(zhì)粒，得到的DNA片段的長度分別是38kb、40kb、54kb；已知HBsAg基因長度是55kb。步驟3中應(yīng)選用限制酶 BglⅡ
BglⅡ
來切割重組質(zhì)粒以獲得重組DNA，切割后的重組DNA的長度是 136kb
136kb
。
（5）轉(zhuǎn)化的酵母菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時(shí)間后，需要向其中加入甲醇，其目的是 誘導(dǎo)HBsAg基因表達(dá)
誘導(dǎo)HBsAg基因表達(dá)
。
