小麥純合自交系川農(nóng)16具有穗大、粒多、抗病等優(yōu)良特性，可通過(guò)導(dǎo)入抗除草劑基因bar使其獲得抗除草劑性狀，具體技術(shù)路線如圖1所示。其中抗除草劑基因bar來(lái)源于野生型植物甲，抗草甘膦基因aroA是選擇標(biāo)記基因，報(bào)告基因能在特定情況特定組織中表達(dá)。
（1）圖1中構(gòu)建表達(dá)載體的過(guò)程需要用兩種不同的限制酶切割，比用一種限制酶切割的優(yōu)點(diǎn)是

防止目的基因末端任意鏈接、防止目的基因自身環(huán)化、防止目的基因反向連接

防止目的基因末端任意鏈接、防止目的基因自身環(huán)化、防止目的基因反向連接

。很多啟動(dòng)子具有物種特異性，在圖中Ti質(zhì)粒的T-DNA中插入除草劑抗性基因bar時(shí)其上游啟動(dòng)子應(yīng)該選擇

C

C

。
A．野生植物甲啟動(dòng)子
B．農(nóng)桿菌啟動(dòng)子
C．小麥川農(nóng)16的啟動(dòng)子
（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化愈傷組織時(shí)，T-DNA攜帶插入其內(nèi)的片段轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞。篩選已轉(zhuǎn)化的愈傷組織，需使用含

除草劑

除草劑

的選擇培養(yǎng)基。但在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，愈傷組織表面常殘留農(nóng)桿菌，導(dǎo)致未轉(zhuǎn)化愈傷組織也可能在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。含有內(nèi)含子的報(bào)告基因只能在真核生物中正確表達(dá)，其產(chǎn)物能催化無(wú)色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍(lán)色。用K分別處理以下愈傷組織，出現(xiàn)藍(lán)色的是

②④

②④

（多選）。
①無(wú)農(nóng)桿菌附著的未轉(zhuǎn)化愈傷組織
②無(wú)農(nóng)桿菌附著的轉(zhuǎn)化愈傷組織
③農(nóng)桿菌附著的未轉(zhuǎn)化愈傷組織
④農(nóng)桿菌附著的轉(zhuǎn)化愈傷組織
（3）轉(zhuǎn)化后經(jīng)篩選的愈傷組織需轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，此時(shí)培養(yǎng)基需添加的植物激素為

生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素

生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素

，部分接種在無(wú)激素培養(yǎng)基上的芽也能長(zhǎng)根，原因是

植物細(xì)胞具有全能性，芽頂端合成的生長(zhǎng)素向基部運(yùn)輸，促進(jìn)根的分化

植物細(xì)胞具有全能性，芽頂端合成的生長(zhǎng)素向基部運(yùn)輸，促進(jìn)根的分化

。培養(yǎng)獲得的轉(zhuǎn)基因植株不一定穩(wěn)定遺傳，須將轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行

自交

自交

，繼續(xù)篩選，最終選育出抗除草劑純合系。
（4）T-DNA序列可隨機(jī)插入到愈傷組織DNA中導(dǎo)致插入位點(diǎn)基因功能喪失。上述實(shí)驗(yàn)中偶然獲得了一個(gè)突變體F，產(chǎn)量明顯低于小麥川農(nóng)16。研究者用某種限制酶處理突變體F的DNA，得到圖2，若以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增出T-DNA插入位置兩側(cè)的未知序列，需選擇的引物是

①④

①④

。