綠色熒光蛋白(GFP)是水母體內的一種發(fā)光蛋白,其編碼基因可作為基因工程中載體上的標記基因。研究人員在pBIN19質粒的LacZ基因(β-半乳糖苷酶基因)內部插入GFP基因和CaMV35S(強啟動子)構建成可用于培育轉基因植物的質粒載體pBIN-35S-GFP(如圖所示)?;卮鹣铝袉栴}:
注:質粒上“LB→……←RB”片段為T-DNA片段,Kmr基因為卡那霉素抗性基因,質粒上限制酶的識別序列省略未標出。
(4)構建pBIN-35S-GFP載體的過程中需要用到 限制酶和DNA連接限制酶和DNA連接酶,要插入CaMV35S的目的是 啟動GFP基因的表達啟動GFP基因的表達,因此CaMV35S需插入到GFP基因的 上游上游。
(5)已知β-半乳糖苷酶能將無色的X-gal分解為半乳糖和藍色的5-溴-4-氯靛藍。把GFP基因和CaMV35S插入到LacZ基因的內部,除了通過菌落是否產生綠色熒光來篩選導入質粒pBIN-35S-GFP外,還可以通過添加了 卡那霉素和X-gal卡那霉素和X-gal培養(yǎng)基,菌落顏色呈 白白色的就是導入了質粒pBIN-35S-GFP的受體菌的克隆。
(6)若用pBIN-35S-GFP載體采用農桿菌轉化法進行植物轉基因操作,外植體轉化完成后常用抗生素進行除菌。若利用PCR技術判定農桿菌是否已經除盡,可根據(jù) oriV或oriT或KmroriV或oriT或Kmr(填圖中質粒片段名稱)基因的序列設計引物,對PCR的產物進行凝膠電泳,若 無PCR產物條帶無PCR產物條帶,說明外植體中已無農桿菌殘留。
(7)綠色熒光蛋白基因可作為基因工程中載體上的標記基因。綠色熒光蛋白則可用于研究蛋白質在細胞中的定位,原因除了綠色熒光蛋白能夠發(fā)熒光外,還有一重要原因是GFP結合到被研究的目的蛋白的末端,不影響該蛋白的 生物學活性生物學活性,還是按照無GFP結合的蛋白同樣的路徑運轉。要使GFP結合到目的蛋白的末端,構建重組質粒時目的基因、GFP基因、CaMV35S的連接順序為 CaMV35S→目的基因→GFP基因CaMV35S→目的基因→GFP基因(用“→”回答)。
【考點】基因工程的操作過程綜合.
【答案】限制酶和DNA連接;啟動GFP基因的表達;上游;卡那霉素和X-gal;白;oriV或oriT或Kmr;無PCR產物條帶;生物學活性;CaMV35S→目的基因→GFP基因
【解答】
【點評】
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