phb2蛋白具有抑制細胞增殖的作用。為初步探究某動物phb2蛋白抑制人宮頸癌細胞增殖的原因,研究者從基因數據庫中獲取了該蛋白的基因編碼序列(簡稱phb2基因),大小為0.9kb(1kb=1000堿基對),利用大腸桿菌表達該蛋白。下圖1是phb2基因編碼區(qū)序列以及兩端需添加的能被相關酶識別的序列,圖2為研究所用表達載體示意圖,表格為有關的限制酶種類及識別序列和切割位點?;卮鹣铝袉栴}。
限制酶種類 |
SpeⅠ |
PvitⅡ |
BamHⅠ |
XbaⅠ |
識別序列 |
5'A↓CTAGT3' |
5'CAG↓CTG3' |
5'G↓GATCC3' |
5'T↓CTAGA3' |
(1)用PCR擴增phb2基因時,為了使PCR產物能被限制酶切割,以便構建基因表達載體,可以考慮在引物的
5'端
5'端
(填“3'端”或“5'端”)添加限制酶識別序列。據圖可推斷,擴增α鏈時需添加的限制酶識別序列以及所用引物的堿基序列是
5'CAGCTGTCATTT3'
5'CAGCTGTCATTT3'
(寫出12個堿基并注明方向)。經過這兩種酶酶切的phb2基因和載體進行連接時,可選用
T4DNA連接酶
T4DNA連接酶
(填“E。coliDNA連接酶”或“T
4DNA連接酶”)。
(2)構建的基因表達載體中需要使用大腸桿菌蛋白基因的啟動子tac,其原因是
tac有利于目的基因在大腸桿菌細胞內表達
tac有利于目的基因在大腸桿菌細胞內表達
。
(3)將轉化后的大腸桿菌接種在含
氨芐青霉素
氨芐青霉素
的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng),隨機挑取菌落(分別編號為1、2、3、4)培養(yǎng)并提取質粒,用(1)中選用的兩種限制酶進行酶切,酶切產物經電泳分離,結果如圖3,
3
3
號菌落的質粒很可能是含目的基因的重組質粒。
注:M為指示分子大小的標準參照物;小于0.2kb的DNA分子條帶未出現在圖中。
(4)在篩選出成功導入phb2基因的大腸桿菌后,經多代培養(yǎng)仍能提取出phb2基因,你認為phb2基因是否已成功轉化?你的觀點及理由是
不一定,轉化是指目的基因成功導入受體細胞并穩(wěn)定存在和表達,僅提取到phb2目的基因不能說明它能否正常表達
不一定,轉化是指目的基因成功導入受體細胞并穩(wěn)定存在和表達,僅提取到phb2目的基因不能說明它能否正常表達
。