phb2蛋白具有抑制細胞增殖的作用。為初步探究某動物phb2蛋白抑制人宮頸癌細胞增殖的原因，研究者從基因數據庫中獲取了該蛋白的基因編碼序列（簡稱phb2基因），大小為0.9kb（1kb=1000堿基對），利用大腸桿菌表達該蛋白。下圖1是phb2基因編碼區(qū)序列以及兩端需添加的能被相關酶識別的序列，圖2為研究所用表達載體示意圖，表格為有關的限制酶種類及識別序列和切割位點?；卮鹣铝袉栴}。
| 限制酶種類 |
SpeⅠ |
PvitⅡ |
BamHⅠ |
XbaⅠ |
| 識別序列 |
5'A↓CTAGT3' |
5'CAG↓CTG3' |
5'G↓GATCC3' |
5'T↓CTAGA3' |
（1）用PCR擴增phb2基因時，為了使PCR產物能被限制酶切割，以便構建基因表達載體，可以考慮在引物的
5'端
5'端
（填“3'端”或“5'端”）添加限制酶識別序列。據圖可推斷，擴增α鏈時需添加的限制酶識別序列以及所用引物的堿基序列是
5'CAGCTGTCATTT3'
5'CAGCTGTCATTT3'
（寫出12個堿基并注明方向）。經過這兩種酶酶切的phb2基因和載體進行連接時，可選用
T4DNA連接酶
T4DNA連接酶
（填“E。coliDNA連接酶”或“T
4DNA連接酶”）。
（2）構建的基因表達載體中需要使用大腸桿菌蛋白基因的啟動子tac,其原因是
tac有利于目的基因在大腸桿菌細胞內表達
tac有利于目的基因在大腸桿菌細胞內表達
。
（3）將轉化后的大腸桿菌接種在含
氨芐青霉素
氨芐青霉素
的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，隨機挑取菌落（分別編號為1、2、3、4）培養(yǎng)并提取質粒，用（1）中選用的兩種限制酶進行酶切，酶切產物經電泳分離，結果如圖3，
3
3
號菌落的質粒很可能是含目的基因的重組質粒。
注：M為指示分子大小的標準參照物；小于0.2kb的DNA分子條帶未出現在圖中。
（4）在篩選出成功導入phb2基因的大腸桿菌后，經多代培養(yǎng)仍能提取出phb2基因，你認為phb2基因是否已成功轉化？你的觀點及理由是
不一定，轉化是指目的基因成功導入受體細胞并穩(wěn)定存在和表達，僅提取到phb2目的基因不能說明它能否正常表達
不一定，轉化是指目的基因成功導入受體細胞并穩(wěn)定存在和表達，僅提取到phb2目的基因不能說明它能否正常表達
。
