水蛭素是水蛭唾液腺分泌的一種蛋白質(zhì)，是一種優(yōu)良的凝血酶抑制劑，在血栓治療上有著重要的醫(yī)學(xué)價值。已知天然水蛭素的抗凝血活性較低，產(chǎn)量和來源有限，某科研團(tuán)隊擬通過一定的技術(shù)手段改造水蛭素基因，通過制備山羊乳腺生物反應(yīng)器獲得活性高、產(chǎn)量大的重組水蛭素。
回答下列問題：
（1）水蛭素基因的改造：研究發(fā)現(xiàn)，水蛭素的第47位天冬酰胺替換為賴氨酸，可以提高其活性。通過建立功能與結(jié)構(gòu)的聯(lián)系，運(yùn)用

蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)

工程對水蛭素分子進(jìn)行改造：從預(yù)期的水蛭素功能出發(fā)，設(shè)計水蛭素的

空間結(jié)構(gòu)

空間結(jié)構(gòu)

，推測出其氨基酸序列，再依據(jù)

中心法則/mRNA序列/核糖核苷酸序列

中心法則/mRNA序列/核糖核苷酸序列

推測出水蛭素基因的核苷酸序列，進(jìn)而運(yùn)用基因定點(diǎn)突變技術(shù)改造水蛭素基因。
（2）水蛭素基因表達(dá)載體的構(gòu)建：應(yīng)用PCR技術(shù)對改造后的水蛭素基因進(jìn)行擴(kuò)增，在設(shè)計引物時，應(yīng)在引物5'端添加特定限制酶的識別序列，其目的是

便于將水蛭素基因與載體連接

便于將水蛭素基因與載體連接

。將水蛭素基因和表達(dá)載體用

限制酶、DNA連接酶

限制酶、DNA連接酶

酶處理獲得重組DNA分子。
（3）山羊成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化：將無菌條件下采集制備的

雌性

雌性

（填“雌性”或“雄性”）山羊成纖維細(xì)胞懸液作為初始材料進(jìn)行

原代

原代

培養(yǎng)。培養(yǎng)一段時間后，加入胰蛋白酶使細(xì)胞松散，當(dāng)貼壁細(xì)胞趨于球形時加入過量新鮮培養(yǎng)液，目的是

終止（緩解）酶解反應(yīng)

終止（緩解）酶解反應(yīng)

。將帶有重組DNA分子的脂質(zhì)體與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，獲得含有目的基因的受體細(xì)胞。應(yīng)用PCR技術(shù)可精準(zhǔn)鑒定受體細(xì)胞中是否導(dǎo)入了水蛭素基因，若PCR反應(yīng)出現(xiàn)無擴(kuò)增條帶的假陰性結(jié)果，可能的原因有哪幾項？

ABC

ABC

。
A.反應(yīng)溫度不適宜
B.引物量不夠
C.模板量不夠
D.重組DNA未導(dǎo)入
（4）轉(zhuǎn)基因奶山羊的克?。簩⒊晒D(zhuǎn)化的成纖維細(xì)胞的核取出，移入去核的

卵母/卵/受精卵

卵母/卵/受精卵

細(xì)胞中，用電刺激后進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)，將早期胚胎移植到經(jīng)

同期發(fā)情

同期發(fā)情

處理的代孕母子宮內(nèi)，經(jīng)妊娠、分娩獲得轉(zhuǎn)基因克隆奶山羊。
（5）重組水蛭素的獲取和檢測：收集轉(zhuǎn)基因奶山羊乳汁，從中提取得到

蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)

，分子水平上采用

抗原抗體雜交

抗原抗體雜交

技術(shù)鑒定是否含有重組水蛭素，最后使用離子交換層析實現(xiàn)重組水蛭素的

分離（純化）

分離（純化）

。