金屬硫蛋白（MT）是一類(lèi)廣泛存在于動(dòng)植物中具有金屬結(jié)合能力的蛋白質(zhì)，決定該蛋白質(zhì)合成的基因結(jié)構(gòu)如圖1所示，其中A鏈為編碼鏈、B鏈為模板鏈?？蒲腥藛T利用圖2所示質(zhì)粒構(gòu)建棗樹(shù)的MT基因重組DNA分子并導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞，獲得對(duì)重金屬鎘（Cd）具有吸附能力和耐受能力的MT工程菌。

（注：XhoⅠ、KpnⅠ、PstⅠ為不同限制酶的識(shí)別位點(diǎn)；LacZ基因編碼產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶可以催化無(wú)色物質(zhì)X-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，否則菌落為白色；amp^r基因?yàn)榘逼S青霉素抗性基因。）
回答下列問(wèn)題：
（1）獲取目的基因
提取棗樹(shù)細(xì)胞的

mRNA

mRNA

，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA；為了使PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物按照正確的方向與已被酶切的載體連接，克隆MT基因時(shí)應(yīng)選擇的引物組合是

引物Ⅱ和引物Ⅲ

引物Ⅱ和引物Ⅲ

，并在其

5'

5'

（填“5′”或“3′”）末端分別添加限制酶

KpnⅠ和XhoⅠ

KpnⅠ和XhoⅠ

的識(shí)別序列。
（2）構(gòu)建重組DNA分子
①啟動(dòng)子是

RNA聚合酶

RNA聚合酶

識(shí)別并結(jié)合的部位；基因工程中構(gòu)建用于原核生物的表達(dá)載體時(shí)，常用的啟動(dòng)子不包括以下哪一項(xiàng)？

D

D

。
A．噬菌體基因啟動(dòng)子
B．乳酸菌基因啟動(dòng)子
C．大腸桿菌基因啟動(dòng)子
D．棗樹(shù)MT基因啟動(dòng)子
②影響DNA連接反應(yīng)的主要因素除pH與溫度等操作環(huán)境、反應(yīng)時(shí)間、DNA連接酶的種類(lèi)及濃度外，還有

酶濃度、載體濃度、目的基因濃度、載體和目的基因的比例

酶濃度、載體濃度、目的基因濃度、載體和目的基因的比例

等（答出1項(xiàng)即可）。
（3）導(dǎo)入、篩選和鑒定MT工程菌
①將得到的混合物導(dǎo)入到用

Ca²⁺

Ca²⁺

處理的大腸桿菌完成

轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化

實(shí)驗(yàn)。
②將菌液稀釋并涂布在含X-gal和氨芐青霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)后，隨機(jī)挑取

白色

白色

的單菌落可獲得MT工程菌。
③欲進(jìn)一步對(duì)MT工程菌進(jìn)行鑒定，可將挑取出的MT工程菌與

普通大腸桿菌

普通大腸桿菌

分別接種至含

一定濃度的重金屬鎘

一定濃度的重金屬鎘

的LB液體培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，適宜時(shí)間后檢測(cè)菌種數(shù)量。
（4）擴(kuò)大菌種
將MT工程菌接種至發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，培養(yǎng)過(guò)程中可定期取樣并使用細(xì)菌計(jì)數(shù)板對(duì)

菌體

菌體

（填“菌體”或“菌落”）進(jìn)行直接計(jì)數(shù)，以評(píng)估增殖情況。發(fā)酵結(jié)束后，采用

過(guò)濾、沉淀、離心、靜置

過(guò)濾、沉淀、離心、靜置

（答出1項(xiàng)即可）等方法獲得所需的發(fā)酵產(chǎn)品。