In-Fusion技術是一項新型的無縫克隆技術。該技術關鍵是要在目的基因兩端構建與線性化質粒末端相同的DNA序列（即同源序列，通常為15-20bp），然后用In-Fusion酶處理即可實現(xiàn)無縫連接。它的操作步驟大致為：①利用PCR技術將質粒線性化；
②PCR擴增出兩端含線性化質粒同源序列的目的基因；
③目的基因與線性化質粒同源區(qū)域在In-Fusion酶作用下形成重組質粒；
④將重組質粒導入受體細胞。
回答下列問題。

（1）過程①需要用到的酶是

耐高溫的DNA聚合酶

耐高溫的DNA聚合酶

。過程③中，同源序列1與同源序列2中的堿基序列不同，這樣設計的好處是

防止目的基因反向連接，防止線性化質?；蚰康幕蜃陨憝h(huán)化

防止目的基因反向連接，防止線性化質?；蚰康幕蜃陨憝h(huán)化

。
（2）為保證擴增出兩端含線性化質粒同源序列的目的基因，引物A或引物B要依據(jù)

目的基因與質粒

目的基因與質粒

序列進行設計。
（3）若目的基因是氨芐青霉素抗性基因，以大腸桿菌作為受體細胞。為檢測已轉化大腸桿菌的抗性效果，在含有氨芐青霉素和不含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上分別接種等量的已轉化大腸桿菌并培養(yǎng)相同時間，然后采用

稀釋涂布平板

稀釋涂布平板

法進行計數(shù)，若結果較真實值偏小，原因是

當兩個或多個細胞連在一起時，在平板上觀察到的是一個菌落

當兩個或多個細胞連在一起時，在平板上觀察到的是一個菌落

。
（4）與傳統(tǒng)構建重組質粒的方法相比，In-Fusion技術的優(yōu)勢有

不受限制酶酶切位點的限制；可以把目的基因插入任何位點；避免限制酶切割對質粒功能區(qū)的破壞

不受限制酶酶切位點的限制；可以把目的基因插入任何位點；避免限制酶切割對質粒功能區(qū)的破壞

。（至少答出兩點）