COR基因是植物的冷調(diào)節(jié)基因，其編碼的親水性多肽能保護(hù)細(xì)胞免受凍害，具有增強(qiáng)植物抗寒性的作用。轉(zhuǎn)錄因子CBF（由CBF基因控制合成）能夠特異性結(jié)合下游靶基因啟動(dòng)子區(qū)，從而激活COR基因的表達(dá)以提高植物的抗寒性。將不同植物中獲取的CBF基因和COR基因組合起來(lái)構(gòu)建抗寒基因超量表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)能有效提高植物的低溫耐受性。構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)需要根據(jù)載體和目的基因上的限制酶切割位點(diǎn)選擇不同的限制酶，當(dāng)遇到平末端和黏性末端不能連接時(shí)，可利用限制酶Klenow酶特有的5′→3′DNA聚合酶活性，將黏性末端補(bǔ)平后再與平末端連接。
（1）研究小組獲取了一段包含CBF基因的長(zhǎng)DNA片段，根據(jù)已知CBF基因序列設(shè)計(jì)了適宜長(zhǎng)度的引物A和引物B，則在PCR反應(yīng)過(guò)程中至少需要經(jīng)過(guò)
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次復(fù)制才開(kāi)始出現(xiàn)與CBF基因長(zhǎng)度和序列完全吻合的產(chǎn)物；經(jīng)過(guò)四次循環(huán)形成的產(chǎn)物中同時(shí)含有A引物和B引物的DNA占 ，與CBF基因長(zhǎng)度和序列完全吻合的產(chǎn)物占 。
（2）抗寒相關(guān)基因超量表達(dá)依賴于適宜的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可分為組成型啟動(dòng)子（每種組織器官中均發(fā)揮作用）、組織特異型啟動(dòng)子（特定組織器官中才能發(fā)揮作用）和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子（特定條件刺激才能發(fā)揮作用），構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)可單獨(dú)使用某一類型的啟動(dòng)子，也可多種類型組合使用。從減少物質(zhì)和能量消耗的角度出發(fā)，最好選擇 （塊莖組織）特異型啟動(dòng)子和（冷刺激）誘導(dǎo)型啟動(dòng)子組合
（塊莖組織）特異型啟動(dòng)子和（冷刺激）誘導(dǎo)型啟動(dòng)子組合
類型啟動(dòng)子使馬鈴薯塊莖在寒冷刺激下才啟動(dòng)抗寒基因的表達(dá)。
（3）為將COR基因表達(dá)載體和CBF基因組合起來(lái)構(gòu)建抗寒基因超量表達(dá)載體，應(yīng)選擇不同的限制酶分別切割COR基因表達(dá)載體和CBF基因的兩端，目的是 保證COR基因表達(dá)載體和CBF基因的正確連接（避免CBF基因和COR基因表達(dá)載體的自身環(huán)化以及CBF基因的反向連接）
保證COR基因表達(dá)載體和CBF基因的正確連接（避免CBF基因和COR基因表達(dá)載體的自身環(huán)化以及CBF基因的反向連接）
。根據(jù)右圖所示限制酶切割位點(diǎn)和識(shí)別序列，實(shí)驗(yàn)室中構(gòu)建抗寒基因超量表達(dá)載體時(shí)，為實(shí)現(xiàn)經(jīng)XbaⅠ切割后的CBF基因與COR基因表達(dá)載體的連接，應(yīng)選用的限制酶是 SamⅠ、Klenow酶
SamⅠ、Klenow酶
。
（4）轉(zhuǎn)錄因子CBF特異性識(shí)別下游靶基因啟動(dòng)子區(qū)后，可能與 RNA聚合
RNA聚合
酶結(jié)合形成復(fù)合體從而激活COR基因的表達(dá)。
（5）科學(xué)家成功培育出抗寒基因超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物后，篩選到一個(gè)AtNUP160基因突變的植株（AtNUP160突變體），已知AtNUP160基因表達(dá)產(chǎn)物能通過(guò)參與核孔復(fù)合體的形成影響RNA的出核轉(zhuǎn)運(yùn)，在植物抗寒過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，AtNUP160突變體中CBF基因的表達(dá)水平降低，進(jìn)而影響了COR基因的表達(dá)，植物抗寒能力減弱。由此推斷AtNUP160突變體抗寒能力減弱的機(jī)理是 atnup160突變體中AtNUP160基因表達(dá)產(chǎn)物減少，影響核孔復(fù)合體的形成，導(dǎo)致CBF基因轉(zhuǎn)錄形成的mRNA無(wú)法轉(zhuǎn)運(yùn)出核，轉(zhuǎn)錄因子CBF減少，使得COR基因的表達(dá)水平明顯降低，產(chǎn)生保護(hù)細(xì)胞免受凍害的親水性多肽減少，植物抗寒能力減弱
atnup160突變體中AtNUP160基因表達(dá)產(chǎn)物減少，影響核孔復(fù)合體的形成，導(dǎo)致CBF基因轉(zhuǎn)錄形成的mRNA無(wú)法轉(zhuǎn)運(yùn)出核，轉(zhuǎn)錄因子CBF減少，使得COR基因的表達(dá)水平明顯降低，產(chǎn)生保護(hù)細(xì)胞免受凍害的親水性多肽減少，植物抗寒能力減弱
。【答案】3；
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；（塊莖組織）特異型啟動(dòng)子和（冷刺激）誘導(dǎo)型啟動(dòng)子組合；保證COR基因表達(dá)載體和CBF基因的正確連接（避免CBF基因和COR基因表達(dá)載體的自身環(huán)化以及CBF基因的反向連接）；SamⅠ、Klenow酶；RNA聚合；atnup160突變體中AtNUP160基因表達(dá)產(chǎn)物減少，影響核孔復(fù)合體的形成，導(dǎo)致CBF基因轉(zhuǎn)錄形成的mRNA無(wú)法轉(zhuǎn)運(yùn)出核，轉(zhuǎn)錄因子CBF減少，使得COR基因的表達(dá)水平明顯降低，產(chǎn)生保護(hù)細(xì)胞免受凍害的親水性多肽減少，植物抗寒能力減弱
