COR基因是植物的冷調節(jié)基因，其編碼的親水性多肽能保護細胞免受凍害，具有增強植物抗寒性的作用。轉錄因子CBF（由CBF基因控制合成）能夠特異性結合下游靶基因啟動子區(qū)，從而激活COR基因的表達以提高植物的抗寒性。將不同植物中獲取的CBF基因和COR基因組合起來構建抗寒基因超量表達載體，轉入植物體內能有效提高植物的低溫耐受性。構建基因表達載體時需要根據(jù)載體和目的基因上的限制酶切割位點選擇不同的限制酶，當遇到平末端和黏性末端不能連接時，可利用限制酶Klenow酶特有的5′→3′DNA聚合酶活性，將黏性末端補平后再與平末端連接。
（1）研究小組獲取了一段包含CBF基因的長DNA片段，根據(jù)已知CBF基因序列設計了適宜長度的引物A和引物B，則在PCR反應過程中至少需要經過

3

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次復制才開始出現(xiàn)與CBF基因長度和序列完全吻合的產物；經過四次循環(huán)形成的產物中同時含有A引物和B引物的DNA占

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，與CBF基因長度和序列完全吻合的產物占

1

2

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。
（2）抗寒相關基因超量表達依賴于適宜的啟動子。啟動子可分為組成型啟動子（每種組織器官中均發(fā)揮作用）、組織特異型啟動子（特定組織器官中才能發(fā)揮作用）和誘導型啟動子（特定條件刺激才能發(fā)揮作用），構建基因表達載體時可單獨使用某一類型的啟動子，也可多種類型組合使用。從減少物質和能量消耗的角度出發(fā)，最好選擇

（塊莖組織）特異型啟動子和（冷刺激）誘導型啟動子組合

（塊莖組織）特異型啟動子和（冷刺激）誘導型啟動子組合

類型啟動子使馬鈴薯塊莖在寒冷刺激下才啟動抗寒基因的表達。

（3）為將COR基因表達載體和CBF基因組合起來構建抗寒基因超量表達載體，應選擇不同的限制酶分別切割COR基因表達載體和CBF基因的兩端，目的是

保證COR基因表達載體和CBF基因的正確連接（避免CBF基因和COR基因表達載體的自身環(huán)化以及CBF基因的反向連接）

保證COR基因表達載體和CBF基因的正確連接（避免CBF基因和COR基因表達載體的自身環(huán)化以及CBF基因的反向連接）

。根據(jù)右圖所示限制酶切割位點和識別序列，實驗室中構建抗寒基因超量表達載體時，為實現(xiàn)經XbaⅠ切割后的CBF基因與COR基因表達載體的連接，應選用的限制酶是

SamⅠ、Klenow酶

SamⅠ、Klenow酶

。
（4）轉錄因子CBF特異性識別下游靶基因啟動子區(qū)后，可能與

RNA聚合

RNA聚合

酶結合形成復合體從而激活COR基因的表達。
（5）科學家成功培育出抗寒基因超量表達的轉基因植物后，篩選到一個AtNUP160基因突變的植株（AtNUP160突變體），已知AtNUP160基因表達產物能通過參與核孔復合體的形成影響RNA的出核轉運，在植物抗寒過程中發(fā)揮重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，AtNUP160突變體中CBF基因的表達水平降低，進而影響了COR基因的表達，植物抗寒能力減弱。由此推斷AtNUP160突變體抗寒能力減弱的機理是

atnup160突變體中AtNUP160基因表達產物減少，影響核孔復合體的形成，導致CBF基因轉錄形成的mRNA無法轉運出核，轉錄因子CBF減少，使得COR基因的表達水平明顯降低，產生保護細胞免受凍害的親水性多肽減少，植物抗寒能力減弱

atnup160突變體中AtNUP160基因表達產物減少，影響核孔復合體的形成，導致CBF基因轉錄形成的mRNA無法轉運出核，轉錄因子CBF減少，使得COR基因的表達水平明顯降低，產生保護細胞免受凍害的親水性多肽減少，植物抗寒能力減弱

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