野生茄子具有耐鹽基因StP5CS。研究人員擴(kuò)增StP5CS 基因并雙酶切該基因和改造后的中間載體pCAMBIA1301,經(jīng)DNA 連接酶連接酶切產(chǎn)物,最終得到下圖1所示的植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-StP5CS。將該植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞進(jìn)而獲得了耐鹽植株?;卮鹣铝袉?wèn)題:
(1)提取茄子幼嫩葉片的總RNA,在
逆轉(zhuǎn)錄酶
逆轉(zhuǎn)錄酶
的催化下合成cDNA,再通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增StP5CS基因。PCR利用 DNA雙鏈復(fù)制
DNA雙鏈復(fù)制
的原理。
(2)擴(kuò)增StP5CS 基因的上游引物為 ZHPs:5'-CACATTTCTGCTCCTACATT-3',下游引物為ZHPa:5'-CTTCCTAAATACACAACTGGAT-3',兩種引物中C+G 的比例保持一致主要是為了保證 引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合(復(fù)性)過(guò)程溫度相近,
引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合(復(fù)性)過(guò)程溫度相近,
。StP5CS基因PCR擴(kuò)增的每次循環(huán)分為3步,在循環(huán)前常要進(jìn)行一次94℃、5min預(yù)變性,其目的是 增加模板DNA徹底變性的概率(使模板DNA充分變性)
增加模板DNA徹底變性的概率(使模板DNA充分變性)
。
(3)構(gòu)建耐鹽基因StP5CS表達(dá)載體時(shí),用限制酶BamHⅠ和SmaⅠ切割質(zhì)粒pCAMBIA1301,15 min后需將溫度從36℃升高至65℃左右并保溫20min,目的是 使限制酶失活
使限制酶失活
,從而終止酶切反應(yīng)。mRNA合成方向是5′→3′,圖2是StP5CS基因示意圖,為使其能正確插入表達(dá)載體并成功表達(dá),則圖中P處的堿基序列應(yīng)為5'-CCCGGG
CCCGGG
-3'。
(4)若將該表達(dá)載體導(dǎo)入柑橘細(xì)胞中,常用 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
法,表達(dá)載體上的Ori可以保證其在柑橘細(xì)胞中能 自我復(fù)制
自我復(fù)制
。