野生茄子具有耐鹽基因StP5CS。研究人員擴(kuò)增StP5CS 基因并雙酶切該基因和改造后的中間載體pCAMBIA1301，經(jīng)DNA 連接酶連接酶切產(chǎn)物，最終得到下圖1所示的植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-StP5CS。將該植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞進(jìn)而獲得了耐鹽植株?；卮鹣铝袉?wèn)題：

（1）提取茄子幼嫩葉片的總RNA，在 

逆轉(zhuǎn)錄酶

逆轉(zhuǎn)錄酶

 的催化下合成cDNA，再通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增StP5CS基因。PCR利用 

DNA雙鏈復(fù)制

DNA雙鏈復(fù)制

 的原理。
（2）擴(kuò)增StP5CS 基因的上游引物為 ZHPs：5'-CACATTTCTGCTCCTACATT-3'，下游引物為ZHPa：5'-CTTCCTAAATACACAACTGGAT-3'，兩種引物中C+G 的比例保持一致主要是為了保證 

引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合（復(fù)性）過(guò)程溫度相近，

引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合（復(fù)性）過(guò)程溫度相近，

。StP5CS基因PCR擴(kuò)增的每次循環(huán)分為3步，在循環(huán)前常要進(jìn)行一次94℃、5min預(yù)變性，其目的是 

增加模板DNA徹底變性的概率（使模板DNA充分變性）

增加模板DNA徹底變性的概率（使模板DNA充分變性）

。
（3）構(gòu)建耐鹽基因StP5CS表達(dá)載體時(shí)，用限制酶BamHⅠ和SmaⅠ切割質(zhì)粒pCAMBIA1301，15 min后需將溫度從36℃升高至65℃左右并保溫20min,目的是

使限制酶失活

使限制酶失活

，從而終止酶切反應(yīng)。mRNA合成方向是5′→3′，圖2是StP5CS基因示意圖，為使其能正確插入表達(dá)載體并成功表達(dá)，則圖中P處的堿基序列應(yīng)為5'-

CCCGGG

CCCGGG

-3'。
（4）若將該表達(dá)載體導(dǎo)入柑橘細(xì)胞中，常用

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

法，表達(dá)載體上的Ori可以保證其在柑橘細(xì)胞中能

自我復(fù)制

自我復(fù)制

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