利用新冠病毒（SARS—CoV—2）包膜表面的S蛋白研發(fā)的疫苗已在我國廣泛接種。如圖表示制備疫苗的相關(guān)過程，其中m、n分別是啟動子和終止子，箭頭處是限制酶的切點，SUC2是酵母菌的蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因，其終產(chǎn)物存在于液泡中，可以催化蔗糖水解成單糖被細(xì)胞利用。下表是可供選擇使用的限制酶及其識別序列和切割位點。

限制酶	BamHI	NheI	NcoI	SphI	Sau3AI
識別序列和切割位點	5'-G↓CTAGC-3'	5'-G↓GATCC-3'	5'-C↓CATGG-3'	5'-GCATG↓C-3'	5'-↓GATC-3'

（1）已知依據(jù)S蛋白的RNA制備的目的基因S上無合適的限制酶識別序列，為了使目的基因S更好地與載體A連接，需要在PCR擴增之前設(shè)計兩種引物分子，應(yīng)在兩種引物分子的

5'

5'

（填“5′”或“3′”）端添加合適的限制酶的識別序列。如圖②過程所使用的兩種酶是

NheI、NcoI

NheI、NcoI

，選擇兩種酶切割的優(yōu)點是

形成不同的粘性末端，防止質(zhì)粒及目的基因自連及目的基因反接

形成不同的粘性末端，防止質(zhì)粒及目的基因自連及目的基因反接

。
（2）由圖推測，目的基因S表達(dá)的模板鏈?zhǔn)?

上鏈

上鏈

（填“上鏈”或“下鏈”），理由是

3'→5'方向與m→n相同

3'→5'方向與m→n相同

。
（3）RT一PCR是將RNA逆轉(zhuǎn)錄（RT）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。利用S蛋白的RNA作為模板進(jìn)行過程①，首先需要加入緩沖液、原料、酶Ⅰ、引物Ⅰ等物質(zhì)后進(jìn)行RT，獲得單鏈DNA后，還需要添加與單鏈DNA互補的引物Ⅱ及酶Ⅱ，在PCR過程中酶Ⅰ所處的狀態(tài)是

失活

失活

。以一個單鏈DNA為起點，進(jìn)行n次循環(huán)的擴增，理論上需要

2^n-1

2^n-1

個引物Ⅱ。
（4）SUC2作為B上的標(biāo)記基因，可以對導(dǎo)入B的酵母菌進(jìn)行篩選。篩選時，需要使用以蔗糖為唯一碳源的培養(yǎng)基，對受體突變型酵母菌的要求是

不含SUC2基因或者SUC2基因被敲除

不含SUC2基因或者SUC2基因被敲除

。