糖化酶是將淀粉轉化為葡萄糖的酶，大部分野生酵母菌因缺乏糖化酶基因而不能直接利用淀粉。研究人員將經(jīng)誘變處理后獲取的黑曲霉菌高產(chǎn)糖化酶基因導入畢赤酵母CS115（對氨芐青霉素不敏感）中，構建能直接利用淀粉的工程菌，該過程所用質(zhì)粒（僅示部分結構）如圖1所示。質(zhì)粒的外側鏈為a鏈，內(nèi)側鏈為b鏈。基因Amp^r轉錄的模板鏈屬于b鏈的片段。三種限制酶的識別序列及切割位點見下表。請回答下列問題。

限制酶	BamHⅠ	PstⅠ	XbaⅠ
識別序列和切割位點（5′→3′）	G↓GATCC	C↓TGCAG	T↓CTAGA

（1）為獲得糖化酶高產(chǎn)菌株，研究人員將經(jīng)誘變處理后的黑曲霉菌接種到

淀粉

淀粉

含量高的培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)適宜時間后滴加碘液，挑選出透明圈（不產(chǎn)生藍色）直徑

較大

較大

的菌株，再進行復篩以及穩(wěn)定性遺傳實驗。
（2）質(zhì)粒復制的模板鏈是

a和b

a和b

（選填“a”、“b”、“a和b”、“a或b”）鏈。高產(chǎn)糖化酶基因插入質(zhì)粒后，其轉錄的模板鏈屬于

a

a

鏈的片段。
（3）構建高產(chǎn)糖化酶基因表達載體時，使用限制酶切割pPIC9K，37℃，15min后需將溫度升高至65℃并保溫20min,目的是使

限制酶失活

限制酶失活

，從而終止酶切反應。圖2是高產(chǎn)糖化酶基因示意圖（僅示部分堿基），為使其能定向插入表達載體并成功表達，則PCR擴增時引物的堿基序列為

①④

①④

。
①5′-TCTAGATCTGTTGAAT-3′②5′-TCTAGAAGACAACTTA-3′
③5′-CTGCAGCTTGGATGAT-3′④5′-GGATCCCTTGGATGAT-3′
⑤5′-GGATCCGAACCTACTA-3′⑥5′-CTCGAGTCTGTTGAAT-3′
（4）畢赤酵母GS115是一種組氨酸營養(yǎng)缺陷型微生物，自身不能合成生長必需的組氨酸，因此可利用

不含組氨酸

不含組氨酸

的基礎培養(yǎng)基（不含淀粉）初步篩選導入高產(chǎn)糖化酶基因表達載體的畢赤酵母GS115，再將篩選出的細胞轉接至含甲醇的培養(yǎng)液中進行發(fā)酵產(chǎn)酶性能測定。