Gateway克隆技術(shù)是一種快速，高效地構(gòu)建基因表達(dá)載體的方法，是基于λ噬菌體可以和大腸桿菌DNA的特定位點(diǎn)發(fā)生互換的特點(diǎn)設(shè)計(jì)的。Gateway克隆技術(shù)依賴于BP反應(yīng)和LR反應(yīng)，通過BP反應(yīng)將目的基因連接到質(zhì)粒1上，獲得克隆質(zhì)粒2，再通過LR反應(yīng)將目的基因連接到載體質(zhì)粒3上，獲得表達(dá)載體，如圖所示。請回答下列問題：
（1）為構(gòu)建基因表達(dá)載體，需先設(shè)計(jì)引物，通過PCR特異性擴(kuò)增目的基因，用于擴(kuò)增目的基因的引物需滿足的條件是

能與目的基因兩端的堿基序列互補(bǔ)配對

能與目的基因兩端的堿基序列互補(bǔ)配對

，為使PCR產(chǎn)物能參與后續(xù)交換，需要分別在2種引物上添加相應(yīng)的attB1和attB2序列，該序列應(yīng)添加在引物的

5′端

5′端

（填“3′端”或“5′端”）。
（2）BP反應(yīng)中，將帶有attB1和attB2序列的目的基因與質(zhì)粒1混合，加入BP克隆酶，attB和attP位點(diǎn)之間會發(fā)生互換。該反應(yīng)體系中可能含有未交換的質(zhì)粒1和交換后的質(zhì)粒2，為從體系中篩選出質(zhì)粒2，使混合體系中的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化用Ca²⁺處理的大腸桿菌，并涂布到含有青霉素的平板上。Ca²⁺處理的目的是

使大腸桿菌處于能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)

使大腸桿菌處于能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)

。理論上，在平板上長出菌落的大腸桿菌中含有的質(zhì)粒即為質(zhì)粒2，理由是

質(zhì)粒2含有青霉素抗性基因且不具有ccdB基因，導(dǎo)入該質(zhì)粒的大腸桿菌能在含青霉素的平板上增殖；而質(zhì)粒1含有ccdB基因，其表達(dá)的產(chǎn)物能抑制大腸桿菌的增殖

質(zhì)粒2含有青霉素抗性基因且不具有ccdB基因，導(dǎo)入該質(zhì)粒的大腸桿菌能在含青霉素的平板上增殖；而質(zhì)粒1含有ccdB基因，其表達(dá)的產(chǎn)物能抑制大腸桿菌的增殖

。
（3）LR反應(yīng)中，將質(zhì)粒2和質(zhì)粒3混合，加入LR克隆酶，attL和attR位點(diǎn)之間會發(fā)生互換。為從反應(yīng)體系中篩選出最終的基因表達(dá)載體，應(yīng)將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布到含有

卡那霉素

卡那霉素

的平板上。獲得的基因表達(dá)載體除含有圖示的目的基因和卡那霉素抗性基因外，還必須有

啟動子和終止子

啟動子和終止子

等。
（4）在LR反應(yīng)體系中，相應(yīng)片段發(fā)生互換后，所得產(chǎn)物

不能

不能

（填“能”或“不能”）再次互換回到初始狀態(tài)，原因是

attL與attR序列互換后序列發(fā)生改變，而體系中的LR克隆酶具有專一性

attL與attR序列互換后序列發(fā)生改變，而體系中的LR克隆酶具有專一性

。