土壤鹽堿化問題已經(jīng)成為全球性難題，培育耐鹽堿農(nóng)作物是解決人類糧食安全和農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要途徑。
（l）為研究高粱鹽堿響應通路中相關基因AT1的作用，研究人員構(gòu)建過表達植株（AT1-OE）。以高粱cDNA為模板，利用

PCR

PCR

方法獲取目的基因。如圖1，選取最佳限制酶

BamH I和EcoR I

BamH I和EcoR I

處理目的基因和質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。將轉(zhuǎn)化成功的農(nóng)桿菌與高粱傷組織共培養(yǎng)，篩選T-DNA成功轉(zhuǎn)入的愈傷組織，使用既能殺死原核細胞，又能殺死真核細胞的潮霉素，效果優(yōu)于僅能殺死原核細胞的抗生素（如卡那霉素），原因是

未轉(zhuǎn)入T-DNA的植物細胞無法生長

未轉(zhuǎn)入T-DNA的植物細胞無法生長

。進一步篩選獲得所需愈傷組織，經(jīng)

再分化

再分化

發(fā)育成完整植株。同時構(gòu)建基因敲除植株（AT1-KO）。

（2）檢測植株在高堿土壤中的幼苗長勢和作物產(chǎn)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：相比野生型植株，AT1-KO植株

幼苗長勢好、作物產(chǎn)量高

幼苗長勢好、作物產(chǎn)量高

，AT1-OE植株表型相反，說明AT1在高粱堿脅迫的響應過程中起負調(diào)控作用。
（3）高堿條件下，植物細胞內(nèi)H₂O₂含量升高，推測AT1可能與運輸H₂O₂的通道蛋白PIP2有相互作用。利用免疫共沉淀方法進行研究，實驗原理如圖2，若靶蛋白A和待測蛋白B有相互作用，用磁珠偶聯(lián)抗A抗體使A沉淀，則B也會被沉淀下來。利用抗GFP抗體與磁珠偶聯(lián)，對實驗組和對照組總蛋白進行免疫共沉淀，實驗結(jié)果如圖3。
  ①檢測總蛋白的目的是

確保免疫共沉淀前的樣品中有靶蛋白A和待測蛋白B

確保免疫共沉淀前的樣品中有靶蛋白A和待測蛋白B

。
  ②通過條帶

3

3

可以判斷，AT1與PIP2有相互作用。若想進一步驗證該相互作用，可用

抗PIP2

抗PIP2

抗體與新磁珠偶聯(lián)再次進行實驗。
（4）細胞內(nèi)過量的H₂O₂積累會導致氧化應激，從而導致植物細胞死亡，降低植物存活率。研究顯示PIP2磷酸化能夠促進H₂O₂外排。綜合上述信息，解釋敲除AT1基因能顯著提高植株耐鹽堿性的原因是

高堿環(huán)境中AT1與PIP2相互作用抑制其磷酸化，從而抑制H₂O₂外排，導致植物細胞死亡；敲除AT1基因后，PIP2磷酸化上升，促進H₂O₂外排，作物存活率提高

高堿環(huán)境中AT1與PIP2相互作用抑制其磷酸化，從而抑制H₂O₂外排，導致植物細胞死亡；敲除AT1基因后，PIP2磷酸化上升，促進H₂O₂外排，作物存活率提高

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