同源重組技術(shù)結(jié)合tet^r-sacB雙重選擇系統(tǒng)可對(duì)基因進(jìn)行敲除與回補(bǔ)，研究基因的功能。圖1是科研人員利用該方法對(duì)大腸桿菌tacZ基因進(jìn)行敲除與回補(bǔ)的相關(guān)過(guò)程，其中tet^r是四環(huán)素抗性基因，sacB基因（2071bp）是蔗糖致死基因，LacZ基因表達(dá)產(chǎn)物能將無(wú)色化合物X-gal水解成藍(lán)色化合物。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：
?
（1）過(guò)程①PCR除需要加入Taq酶、dNTP、緩沖液、Mg²⁺外，還需加入

引物（或P₁、P₂）和模板（或質(zhì)粒1）

引物（或P₁、P₂）和模板（或質(zhì)粒1）

，所加dNTP的作用有

既作為原料又提供能量

既作為原料又提供能量

。
（2）為保證sacB基因和質(zhì)粒2定向連接，設(shè)計(jì)引物P₁、P₂時(shí)，需在引物5'端添加限制酶

BamHⅠ、EcoRⅠ

BamHⅠ、EcoRⅠ

的識(shí)別序列；過(guò)程②需要限制酶和

DNA連接

DNA連接

酶。
（3）過(guò)程③中，需先用Ca²⁺處理大腸桿菌，使其成為

感受態(tài)

感受態(tài)

細(xì)胞。篩選導(dǎo)入質(zhì)粒3的大腸桿菌時(shí)需在培養(yǎng)基中添加

四環(huán)素

四環(huán)素

。
（4）圖2是對(duì)質(zhì)粒3轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證時(shí)的產(chǎn)物電泳結(jié)果，泳道4、5、7對(duì)應(yīng)的菌株可能轉(zhuǎn)化成功，判斷的理由是

4、5、7的電泳結(jié)果接近（或大于）2071bp

4、5、7的電泳結(jié)果接近（或大于）2071bp

。過(guò)程⑤PCR中設(shè)計(jì)引物P₃、P₄時(shí)，需在引物5′端分別添加

LacZ

LacZ

基因兩端的同源序列。
（5）過(guò)程⑦中，在含有四環(huán)素和

X-gal

X-gal

的培養(yǎng)基中出現(xiàn)了白色菌落，即為篩選出的敲除LacZ基因菌株。過(guò)程⑧通過(guò)同源重組技術(shù)結(jié)合tet^r-sacB雙重選擇系統(tǒng)可對(duì)LacZ基因進(jìn)行回補(bǔ)，篩選LacZ基因回補(bǔ)菌株時(shí)應(yīng)在培養(yǎng)基中添加

蔗糖和X-gal

蔗糖和X-gal

。