鏨字石村因甜柿出名而獲“中國甜柿之鄉(xiāng)”。甜柿鮮果肉中含有可溶性糖、微量元素、維生素和β-胡蘿卜素等多種成分，營養(yǎng)價(jià)值高，深受消費(fèi)者的喜愛。甜柿的自然脫澀與乙醛代謝關(guān)鍵酶基因（PDC）密切相關(guān)，推測澀味程度可能與PDC基因的表達(dá)情況有關(guān)。已知啟動(dòng)子區(qū)域存在著許多調(diào)控蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，RNA聚合酶和調(diào)控蛋白共同影響基因的表達(dá)水平。AD基因表達(dá)出的AD蛋白與啟動(dòng)子足夠靠近時(shí)，能夠激活后續(xù)基因轉(zhuǎn)錄，據(jù)此可利用與AD蛋白形成的融合蛋白來篩選待測蛋白。為篩選PDC基因的調(diào)控蛋白，科研人員進(jìn)行了下列實(shí)驗(yàn)?；卮鹣铝袉栴}。

（1）PDC基因的啟動(dòng)子序列未知，為獲得大量該基因啟動(dòng)子所在片段，可利用限制酶將基因組DNA進(jìn)行酶切，然后在

DNA連接酶

DNA連接酶

的作用下將已知序列信息的接頭片段連接在PDC基因的上游，根據(jù)接頭片段和PDC基因編碼序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，引物的作用是

與模板鏈結(jié)合，提供DNA延伸起始位點(diǎn)

與模板鏈結(jié)合，提供DNA延伸起始位點(diǎn)

，目前在PCR反應(yīng)中使用Taq酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是

大腸桿菌DNA聚合酶不耐高溫，在高溫下會(huì)失活

大腸桿菌DNA聚合酶不耐高溫，在高溫下會(huì)失活

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（2）利用質(zhì)粒A構(gòu)建含有PDC基因啟動(dòng)子片段的重組質(zhì)粒并導(dǎo)入代謝缺陷型酵母菌，用不含

尿嘧啶

尿嘧啶

的培養(yǎng)基可篩選出成功轉(zhuǎn)化的酵母菌Y1H；將從甜柿中提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄形成的各種cDNA與質(zhì)粒G連接后導(dǎo)入酵母菌，此時(shí)應(yīng)選擇質(zhì)粒G中的位點(diǎn)

2

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（填序號(hào)1～5）作為cDNA的插入位點(diǎn)，最終獲得攜帶不同cDNA片段的酵母菌群Y187。重組酵母Y1H與Y187能夠進(jìn)行接合生殖，形成的接合子含有兩種酵母菌質(zhì)粒上的所有基因。若接合子能在含有金擔(dān)子素的培養(yǎng)基中生存，則推測待測蛋白是PDC基因的調(diào)控蛋白，請(qǐng)結(jié)合圖丙簡述作出該推測的理由

接合子中待測蛋白與AD蛋白形成了融合蛋白，若待測蛋白是PDC基因的調(diào)控蛋白，就能與PDC基因啟動(dòng)子結(jié)合，AD蛋白也能靠近PDC基因啟動(dòng)子并激活金擔(dān)子素基因的表達(dá)，使酵母菌表現(xiàn)出金擔(dān)子素抗性

接合子中待測蛋白與AD蛋白形成了融合蛋白，若待測蛋白是PDC基因的調(diào)控蛋白，就能與PDC基因啟動(dòng)子結(jié)合，AD蛋白也能靠近PDC基因啟動(dòng)子并激活金擔(dān)子素基因的表達(dá)，使酵母菌表現(xiàn)出金擔(dān)子素抗性

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（3）篩選出PDC基因的調(diào)控蛋白后，為滿足生產(chǎn)上的需要對(duì)其進(jìn)行改良，這種技術(shù)屬于

蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)

工程，該工程的起點(diǎn)是

預(yù)期蛋白質(zhì)的功能

預(yù)期蛋白質(zhì)的功能

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