擬南芥是植物遺傳學(xué)研究上重要的模式生物。在研究與維管發(fā)育相關(guān)的基因時(shí)，研究人員篩選到一花發(fā)育明顯變異的擬南芥突變體ET139。為了探明該表型變異是否由Ds轉(zhuǎn)座突變（Ds為插入基因組的一段特定序列）所造成，需要對Ds插入的DNA序列進(jìn)行分析。交錯(cuò)式熱不對稱PCR（TAIL-PCR）技術(shù)，可用于分離與已知序列鄰近的未知DNA序列。研究人員利用該方法 對擬南芥突變體ET139進(jìn)行分析，方法步驟如下：
（1）獲取模板：提取葉片的
基因組DNA
基因組DNA
，作為擴(kuò)增未知側(cè)翼序列的模板。
（2）引物設(shè)計(jì)：TAIL-PCR使用一套嵌套的序列特異引物（SP）和隨機(jī)簡并引物（AD）組合，進(jìn)行“半特異性PCR反應(yīng)”。本實(shí)驗(yàn)中，特異性引物根據(jù) Ds
Ds
序列設(shè)計(jì)，在其 5’和3’
5’和3’
端設(shè)計(jì)多個(gè)嵌套的引物SP；而隨機(jī)簡并引物AD是較短的混合序列組合。
（3）PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件：
| 反應(yīng) |
反應(yīng)體系 |
|
循環(huán)設(shè)置 |
循環(huán)數(shù) |
| 第1輪 |
水、緩沖液、SP1、AD、
dNTP dNTP 、Taq酶 Taq酶 、模板 |
1
2
3 |
94℃1 min
94℃30 s,62℃1 min,72℃1 min 30 s
94℃30 s,25℃3 min,0.3℃/s→72℃，72℃
2 min 30 s,
94℃30 s,68℃1min,72℃2 min 30 s,
94℃10 s,68℃1 min,72℃2 min 30 s,
94℃30 s,44℃1 min,72℃2 min 30 s
72℃5 min,4℃保持 |
1
5
15 |
| 第2輪 |
第1輪產(chǎn)物為模板、SP2、AD、其余同上 |
1
2 |
94℃30 s,64℃1 min,72℃2 min 30s,
94℃30 s,64℃1 min,72℃2 min30 s,
94℃30 s,44℃1 min,72℃2 min 30 s
72℃5 min,4℃保持 |
12 |
| 第3輪 |
第2輪產(chǎn)物為模板、SP3、AD、其余同上 |
1
2 |
94℃1 min,44℃1 min,72℃2 min 30 s
4℃保持 |
20 |
（4）產(chǎn)物的回收與測序：TAIL-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，對特異條帶回收并測序。將測序結(jié)果序列經(jīng)過數(shù)據(jù)庫與擬南芥
基因組
基因組
（填“基因組”或“cDNA”）進(jìn)行比對。
（5）結(jié)果和分析：TAIL-PCR是利用引物特異性和長短的差異，設(shè)計(jì)不對稱的溫度循環(huán)，通過分級反應(yīng)來擴(kuò)增特異引物，消除非目標(biāo)產(chǎn)物。特異性引物SP退火溫度比隨機(jī)引物AD退火溫度
高
高
（填“高”或“低”），退火在不同溫度下進(jìn)行，則二個(gè)引物或者其中一個(gè)
SP
SP
能夠很好地起作用。TAIL-PCR理想的電泳結(jié)果應(yīng)該是第3輪產(chǎn)物大于300bp且比第2輪產(chǎn)物略
小
小
（填“大”或“小”）；產(chǎn)物中可能會出現(xiàn)多條帶，但一般僅有一條最亮。
本實(shí)驗(yàn)在陽性克隆測序后獲得了大小不同的側(cè)翼序列，其結(jié)果一致，檢測出的側(cè)翼序列為At1g52910基因序列，正常表型的突變體與異常表型的突變體均插入同樣的位點(diǎn)，并且沒有發(fā)現(xiàn)其它插入位點(diǎn)。
（At1g52910由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，Ds插入位點(diǎn)在第2外顯子處）
（6）討論：由以上TAIL-PCR對突變體 ET139檢測結(jié)果推測，突變純合體出現(xiàn)花器官的變異表型，是否由Ds的插入而產(chǎn)生？
不是
不是
，原因是
因?yàn)檎１硇偷耐蛔凅w與異常表型的突變體均有Ds插入同樣的位點(diǎn)，且沒有發(fā)現(xiàn)其它插入位點(diǎn)
因?yàn)檎１硇偷耐蛔凅w與異常表型的突變體均有Ds插入同樣的位點(diǎn)，且沒有發(fā)現(xiàn)其它插入位點(diǎn)
。
