PCR技術(shù)不僅可以擴(kuò)增目的基因，還可用于定點誘變目的基因等。大引物PCR就是一種定點突變技術(shù)。大引物PCR需要用到引物進(jìn)行兩次PCR，其操作步驟為：
①根據(jù)目的基因序列設(shè)計引物，得到兩個常規(guī)引物，分別為常規(guī)上游引物和常規(guī)下游引物；
②根據(jù)突變堿基所處序列位置設(shè)計突變上游引物，突變位點位于突變引物序列的中間位置
③由突變上游引物與常規(guī)下游引物進(jìn)行第一次PCR反應(yīng)得到下游大引物；
④用得到的下游大引物中和另一個常規(guī)上游引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，得到突變目的基因序列?；卮鹣铝袉栴}：
（1）PCR擴(kuò)增的第一步是使雙鏈模板DNA變性。DNA中G+C的含量與變性要求的溫度有關(guān)，DNA中G+C的含量越多，要求的變性溫度越高。其原因是

DNA中G和C之間有三個氫鍵，A和T之間只有兩個氫鍵，G+C含量越多，其氫鍵越多，變性時所需溫度越高

DNA中G和C之間有三個氫鍵，A和T之間只有兩個氫鍵，G+C含量越多，其氫鍵越多，變性時所需溫度越高

。該PCR擴(kuò)增技術(shù)所需的基本條件是

3

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種引物、原料、模板、

耐高溫的DNA聚合酶

耐高溫的DNA聚合酶

。
（2）在第一次PCR反應(yīng)中，形成圖示雙鏈DNA至少要經(jīng)過

2

2

次復(fù)制。第一次PCR的產(chǎn)物DNA的

一

一

條鏈作為第二次PCR所用的引物。與X射線誘變相比，該突變技術(shù)的優(yōu)點是

目的性強(qiáng)、突變概率高

目的性強(qiáng)、突變概率高

。
（3）如果要利用微生物進(jìn)一步克隆PCR定點誘變產(chǎn)物，其步驟包括：

目的基因與載體結(jié)合

目的基因與載體結(jié)合

、

將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞

將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞

、微生物的篩選和培養(yǎng)、從菌群中獲取更多目的基因。將獲取目的基因和質(zhì)粒進(jìn)行連接后，需先用

Ca²⁺

Ca²⁺

處理農(nóng)桿菌以便將基因表達(dá)載體導(dǎo)入馬鈴薯細(xì)胞，將馬鈴薯細(xì)胞培養(yǎng)成幼苗時經(jīng)過的兩個過程是

脫分化和再分化

脫分化和再分化

。檢測目的基因是否在馬鈴薯細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄出了mRNA，所采用的方法是

核酸分子雜交技術(shù)

核酸分子雜交技術(shù)

。