某抗膜蛋白治療性抗體藥物研發(fā)過程中,需要表達N蛋白胞外段,制備相應的單克隆抗體,增加其對N蛋白胞外段特異性結(jié)合的能力。N蛋白胞外段單克隆抗體制備流程如圖1:
(1)用N蛋白胞外段作為抗原對小鼠進行免疫后,取小鼠腺組織用
機械
機械
方法或
胰蛋白
胰蛋白
酶處理,制成細胞懸液,置于含有
95%空氣和5%的CO2
95%空氣和5%的CO2
氣體的CO
2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),離心收集小鼠的B淋巴細胞,與骨髓瘤細胞進行融合。
(2)用選擇性培養(yǎng)基對融合后的細胞進行篩選,獲得雜交瘤細胞,將其接種到96孔板,進行
克隆化
克隆化
培養(yǎng)。用
抗原一抗體雜交
抗原一抗體雜交
技術(shù)檢測每孔中的抗體,篩選既能產(chǎn)生N蛋白胞外段抗體,又能大量增殖的單克隆雜交瘤細胞株,經(jīng)體外擴大培養(yǎng),收集
細胞培養(yǎng)液
細胞培養(yǎng)液
,提取單克隆抗體。
(3)利用上述流程制備的N蛋白胞外段抗體能準確識別
抗原
抗原
的細微差異,與之發(fā)生特異性結(jié)合,并可
大量制備
大量制備
,因此被廣泛用作診斷試劑。
(4)利用小鼠制備的抗體是鼠源抗體,鼠源抗體具有外源性,會被人體免疫系統(tǒng)當作抗原而清除(稱為人抗鼠抗體反應即HAMA反應)??贵w結(jié)構(gòu)示意圖如圖2,引起HAMA反應的主要是“C區(qū)”,通過制備人鼠嵌合抗體可以解決HAMA反應?,F(xiàn)利用重組DNA技術(shù)可以制備人鼠嵌合抗體,請寫出簡要制備思路:
將異源單抗的輕、重鏈可變區(qū)基因插入含有人抗體恒定區(qū)的基因中,并構(gòu)建基因表達載體,利用顯微注射技術(shù)將表達載體導入哺乳動物細胞中,表達出嵌合抗體
將異源單抗的輕、重鏈可變區(qū)基因插入含有人抗體恒定區(qū)的基因中,并構(gòu)建基因表達載體,利用顯微注射技術(shù)將表達載體導入哺乳動物細胞中,表達出嵌合抗體
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(5)為了進一步減少免疫排斥反應,科學家利用噬菌體展示庫技術(shù)生產(chǎn)出全人源化單抗(單抗成分全部由人的基因編碼)。具體操作如下,用PCR技術(shù)從生物體內(nèi)擴增出整套編碼人抗體的基因序列,克隆到噬菌體載體上,并以融合蛋白的形式表達到噬菌體表面,從而可以方便地對抗體進行篩選、擴增。但是利用這種方法制備的抗體結(jié)構(gòu)準確程度下降,原因是
抗體是在原核細胞內(nèi)表達,原核生物不能對真核生物的復雜蛋白進行準確加工
抗體是在原核細胞內(nèi)表達,原核生物不能對真核生物的復雜蛋白進行準確加工
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