基因定點(diǎn)突變是指按照特定的要求，使基因的特定序列發(fā)生插入、刪除、置換、重排等變異。如圖甲是一種PCR介導(dǎo)的基因定點(diǎn)突變示意圖。圖乙是研究人員利用基因M1構(gòu)建基因表達(dá)載體的過(guò)程。

（1）圖甲所示的基因定點(diǎn)突變技術(shù)需要多次PCR，并對(duì)PCR的中間產(chǎn)物A、B進(jìn)行純化，據(jù)圖分析，得到中間產(chǎn)物A、B需要的引物對(duì)分別是

引物1和引物3、引物2和引物4

引物1和引物3、引物2和引物4

，至少要進(jìn)行

2

2

輪循環(huán)。研究人員利用圖中相關(guān)酶對(duì)基因M和產(chǎn)物A、B進(jìn)行充分酶切后得到不同的片段，長(zhǎng)度（kb）如下表，則圖中基因敲除片段的長(zhǎng)度為

0.23kb

0.23kb

，基因M1的長(zhǎng)度為

6.09kb

6.09kb

。

	基因M	A	B
長(zhǎng)度	3.24、2.8、0.15、0.13	2.8、0.09	3.24、0.05

（2）基因M1進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)通常在反應(yīng)緩沖液中添加Mg²⁺，原因是

真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg²⁺激活

真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg²⁺激活

。鑒定PCR產(chǎn)物通常用

瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳

方法。
（3）研究人員將基因M1與Ti質(zhì)粒重構(gòu)前需要在基因M1的C、D兩端分別加上的黏性末端序列為

-TCGA、ACGT-

-TCGA、ACGT-

。構(gòu)建重組質(zhì)粒過(guò)程所需要的酶有

HindⅢ、PstI、DNA連接酶

HindⅢ、PstI、DNA連接酶

。
（4）重組質(zhì)粒能夠完成轉(zhuǎn)化作用的原理是

Ti質(zhì)粒上的T-DNA能夠轉(zhuǎn)移并整合到受體細(xì)胞的染色體上

Ti質(zhì)粒上的T-DNA能夠轉(zhuǎn)移并整合到受體細(xì)胞的染色體上

。