酸性α淀粉酶具有良好的酸穩(wěn)定性，在高麥芽糖漿的生產(chǎn)、工業(yè)廢液的處理等多個(gè)領(lǐng)域有很好的應(yīng)用。以黑曲霉基因組DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增出酸性a淀粉酶的基因（asAA），將asAA插入質(zhì)粒（pPIC9K），獲得的重組質(zhì)粒（pPIC9K-asAA）轉(zhuǎn)化畢赤酵母，在畢赤酵母相關(guān)基因及重組質(zhì)粒的調(diào)控下，酸性α淀粉酶大量表達(dá)并分泌到胞外。EcoRⅠ、NotⅠ和SalⅠ產(chǎn)生的黏性末端不同。

回答問(wèn)題。
（1）用PCR技術(shù)擴(kuò)增asAA時(shí)，應(yīng)從候選引物片段P1-P4中選擇

P2、P3

P2、P3

作為引物：asAA不含質(zhì)粒pPIC9K的相關(guān)酶切位點(diǎn)，應(yīng)在所選引物的5'前增加限制酶

EcoRⅠ和NotⅠ

EcoRⅠ和NotⅠ

的酶切位點(diǎn)，再用

DNA連接

DNA連接

酶構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-asAA。
（2）與導(dǎo)入原核細(xì)胞相比，導(dǎo)入畢赤酵母后酸性α淀粉酶能大量表達(dá)并分泌到胞外的原因是

畢赤酵母是真核生物，含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細(xì)胞器可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行加工修飾

畢赤酵母是真核生物，含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細(xì)胞器可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行加工修飾

。
（3）畢赤酵母細(xì)胞膜上的蛋白酶會(huì)降解表達(dá)產(chǎn)物，影響酸性α淀粉酶的產(chǎn)量。研究人員將重組質(zhì)粒（pPIC9K-asAA）和質(zhì)粒（pPIC9K）分別導(dǎo)入蛋白酶缺陷型畢赤酵母，并對(duì)其分泌的蛋白質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3。圖示樣本1來(lái)自導(dǎo)入

重組質(zhì)粒

重組質(zhì)粒

的蛋白酶缺陷型畢赤酵母，58kD條帶的出現(xiàn)表明

asAA在蛋白酶缺陷的畢赤酵母中得以表達(dá)，不會(huì)被蛋白酶水解

asAA在蛋白酶缺陷的畢赤酵母中得以表達(dá)，不會(huì)被蛋白酶水解

。
（4）酸性α淀粉酶具有酸穩(wěn)定性。分析表明，相較于其他淀粉酶它含有更多的酸性氨基酸，該特性的形成與組成其氨基酸的

種類

種類

有關(guān)。