異丁醇具有燃值高、能量密度高等優(yōu)點(diǎn)，其開發(fā)和利用對(duì)優(yōu)化我國能源結(jié)構(gòu)和保護(hù)環(huán)境有非常重要的戰(zhàn)略意義?；卺劸平湍傅陌l(fā)酵途徑（圖甲）和圖乙的質(zhì)粒，研究者構(gòu)建了一種表達(dá)載體pUC18，用于過表達(dá)ILV2、ILV5、ILV3、AR010基因，以實(shí)現(xiàn)異丁醇的大規(guī)模生產(chǎn)。已知氨芐青霉素能抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的形成。據(jù)此回答下列問題：

（1）圖乙質(zhì)粒上有多個(gè)限制酶切位點(diǎn)，作用是

便于插入外源（基因）DNA片段

便于插入外源（基因）DNA片段

。研究人員先用pUC18轉(zhuǎn)化經(jīng)

Ca²⁺處理

Ca²⁺處理

處理的大腸桿菌，以便篩選、鑒定擴(kuò)增重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒上有

原核生物的復(fù)制原點(diǎn)

原核生物的復(fù)制原點(diǎn)

，所以能在大腸桿菌中擴(kuò)增。
（2）將環(huán)狀載體pUC18導(dǎo)入釀酒酵母時(shí)，一般會(huì)將其進(jìn)行酶切得到線性化載體，隨后再將其導(dǎo)入受體細(xì)胞。根據(jù)所學(xué)的知識(shí)推測酶切得到線性化載體的目的是

線性化載體能整合到釀酒酵母染色體DNA，從而能更穩(wěn)定存在并發(fā)揮功能

線性化載體能整合到釀酒酵母染色體DNA，從而能更穩(wěn)定存在并發(fā)揮功能

。
（3）提取成功構(gòu)建的表達(dá)載體并導(dǎo)入釀酒酵母菌株，將菌株接種在培養(yǎng)基中以獲得單菌落，培養(yǎng)基中

不需要

不需要

（需要/不需要）添加組氨酸，原因是

構(gòu)建的表達(dá)載體中含有組氨酸合成酶基因，酵母菌能利用原料合成組氨酸

構(gòu)建的表達(dá)載體中含有組氨酸合成酶基因，酵母菌能利用原料合成組氨酸

。培養(yǎng)基中需要添加凝固劑

瓊脂

瓊脂

。
（4）異丁醇的大量積累會(huì)傷害細(xì)胞，研究人員給該工程菌導(dǎo)入一個(gè)經(jīng)改造的光敏蛋白基因，使工程菌對(duì)特定的藍(lán)光敏感。進(jìn)行不同的光照處理，使其在異丁醇產(chǎn)生階段和生長繁殖階段進(jìn)行切換，結(jié)果如圖丙所示。
注：5/10/20hpulse分別代表在黑暗條件下每隔5、10、20h發(fā)出15s和65s的藍(lán)光脈沖30min
①對(duì)照組的酵母菌需要導(dǎo)入

不含光敏蛋白基因的載體

不含光敏蛋白基因的載體

。
②以葡萄糖為碳源，利用該轉(zhuǎn)基因釀酒酵母進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，若想進(jìn)一步提高其異丁醇產(chǎn)量，綜合圖甲和圖丙信息，進(jìn)一步優(yōu)化菌株的措施是敲除該工程菌的

ADHs和ALDs

ADHs和ALDs

基因，可采取的工藝措施是

在黑暗條件下每隔10h發(fā)出15s和65s的藍(lán)光脈沖30min

在黑暗條件下每隔10h發(fā)出15s和65s的藍(lán)光脈沖30min

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