Cre酶是一種重組酶，LoxP是能被Cre酶識別的特異DNA序列，當(dāng)一條DNA鏈上存在兩個相同的LoxP序列且方向相同時，Cre酶能有效切除兩個位點(diǎn)間的DNA序列（如圖1）。因此Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)特異位點(diǎn)的基因敲除、基因插入等操作。
（1）啟動子的功能是 驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA；Cre酶與限制酶的功能類似，能將特定部位的兩個核苷酸之間的 磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵斷開。
（2）據(jù)上圖分析，若細(xì)胞中不含有Cre酶，轉(zhuǎn)錄終止信號序列就會抑制下游GFP基因起作用，細(xì)胞無法發(fā)出熒光；若細(xì)胞中含有Cre酶，Cre酶會切除 轉(zhuǎn)錄終止信號序列和LoxP轉(zhuǎn)錄終止信號序列和LoxP，GFP基因就會 表達(dá)表達(dá)，合成綠色熒光蛋白。
（3）當(dāng)細(xì)胞中存在多對Cre酶識別位點(diǎn)和熒光基因時，只有在啟動子之后且與啟動子相鄰的熒光蛋白基因才會表達(dá)，借助大腦成像技術(shù)，通過熒光蛋白“點(diǎn)亮”大腦內(nèi)的神經(jīng)元，試驗(yàn)小鼠不同的腦組織細(xì)胞就會呈現(xiàn)不同的顏色，出現(xiàn)“腦彩虹”。
①若利用PCR技術(shù)擴(kuò)增LoxP基因，需要的引物有 B、CB、C（從圖2中A、B、C、D四種單鏈DNA片段中選擇）。PCR反應(yīng)完成后，常采用 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產(chǎn)物。
②研究者利用限制酶和 DNA連接酶DNA連接酶酶構(gòu)建了含有熒光蛋白基因和Cre酶識別序列的基因表達(dá)載體（圖3），并將其導(dǎo)入小鼠細(xì)胞中，培育出了轉(zhuǎn)基因小鼠。若該小鼠腦細(xì)胞中存在Cre酶且僅識別LoxP2時，腦細(xì)胞的色彩為 黃色和藍(lán)色黃色和藍(lán)色。
【考點(diǎn)】基因工程在農(nóng)牧、醫(yī)療、食品等方面的應(yīng)用．
【答案】驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA；磷酸二酯鍵；轉(zhuǎn)錄終止信號序列和LoxP；表達(dá)；B、C；瓊脂糖凝膠電泳；DNA連接酶；黃色和藍(lán)色
【解答】
【點(diǎn)評】
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發(fā)布：2024/7/7 8:0:9組卷：14引用：2難度：0.6
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1．學(xué)習(xí)以下材料，回答（1）～（4）題。
利用抑制性tRNA進(jìn)行無義突變遺傳病的治療
無義突變是由于某個堿基的改變使代表某種氨基酸的密碼子突變?yōu)榻K止密碼子（UAA、UAG或UGA），從而使肽鏈合成提前終止，造成蛋白質(zhì)的功能改變，引發(fā)相關(guān)疾病。約有10%～15%的人類基因相關(guān)遺傳疾病是由無義突變引發(fā)的。常規(guī)的基因治療是將正?；虻腸DNA序列或是有治療價值的基因（如CRISPR-Cas9相關(guān)的基因編輯工具）通過一定的方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞內(nèi)，達(dá)到替代或修復(fù)缺陷基因、治療疾病的目的。導(dǎo)入基因插入位置不當(dāng)、過高或過低表達(dá)，都可能會導(dǎo)致副作用。盡管基因編輯可以實(shí)現(xiàn)生理水平的基因表達(dá)，但基因編輯工具引入外源蛋白可能引發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)仍然是巨大的挑戰(zhàn)。
抑制性tRNA（sup-tRNA）由天然tRNA改造而來，它的反密碼子通過堿基配對原則可以識別無義突變的終止密碼子，使得mRNA在翻譯至無義突變位點(diǎn)時不啟動翻譯終止而是繼續(xù)向后進(jìn)行翻譯，獲得有功能的全長蛋白。
I型黏多糖貯積癥的病因，是相關(guān)基因發(fā)生無義突變，產(chǎn)生終止密碼子UAG。研究者構(gòu)建小鼠該突變基因mldua和Flag基因融合的載體（圖1），以及針對該無義突變設(shè)計(jì)的sup-tRNA表達(dá)載體（產(chǎn)生的sup-tRNA能夠識別UAG并攜帶酪氨酸Tyr,簡寫作sup-tRNATyr），將其導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與具有相似作用的化合物G418比較，sup--tRNA的作用更加顯著（圖2）；進(jìn)一步利用重組腺相關(guān)病毒作為載體將sup-tRNA導(dǎo)入患病小鼠模型中，實(shí)驗(yàn)顯示能夠降低黏多糖過度積存，實(shí)現(xiàn)對該病癥的有效治療，其療效可以持續(xù)半年以上。
從整體來看，G418在促進(jìn)跨越無義突變位點(diǎn)繼續(xù)翻譯時引入的氨基酸較為隨機(jī)，而sup-tRNA引入的氨基酸較為單一，且不會影響內(nèi)源tRNA穩(wěn)態(tài)，所以sup-tRNA在個體治療中具有很高的安全性，因而在未來基因突變引起的疾病相關(guān)治療中具有非常大的應(yīng)用前景。
（1）侵染時，作為載體的重組腺相關(guān)病毒與靶細(xì)胞膜上的發(fā)生識別，引發(fā)內(nèi)吞，進(jìn)入細(xì)胞后釋放單鏈DNA作為模板，利用宿主細(xì)胞的催化合成其互補(bǔ)DNA鏈，再經(jīng)過過程產(chǎn)生sup-tRNA。
（2）除了引入的氨基酸較為單一，不影響內(nèi)源tRNA穩(wěn)態(tài)，我們還可推斷，用于治療的sup-tRNA在正常終止密碼子處（填“能”或“不能”）繼續(xù)往后翻譯，具有很高的安全性。
（3）研究者構(gòu)建mldua突變基因和Flag基因融合的載體，目的是通過檢測來確定是否跨越無義突變位點(diǎn)繼續(xù)向后翻譯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相比于化合物G418，sup-tRNA在促進(jìn)無義突變位點(diǎn)的翻譯方面更加有效，支持這一結(jié)論的依據(jù)是：。
（4）有文獻(xiàn)報道，已在近1000個不同的人類基因中發(fā)現(xiàn)了7500多個無義突變。常規(guī)的基因治療需要為每種疾病設(shè)計(jì)獨(dú)特的治療策略，這將是一項(xiàng)耗費(fèi)驚人的項(xiàng)目。據(jù)此說明sup-tRNA的應(yīng)用價值。發(fā)布：2025/1/3 8:0:1組卷：26引用：1難度：0.6 -
2．人類基因組計(jì)劃測定了人體的24條染色體，這24條染色體是（ ）
發(fā)布：2024/12/31 0:30:1組卷：112引用：7難度：0.7 -
3．幾丁質(zhì)是許多真菌細(xì)胞壁的重要成分，自然界有些植物能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶催化幾丁質(zhì)水解從而抵抗真菌感染。通過基因工程將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入沒有抗性的植物體內(nèi)，可增強(qiáng)其抗真菌的能力。如圖表示為獲取幾丁質(zhì)酶基因而建立cDNA文庫的過程。
（1）圖示以mRNA為材料通過法獲得cDNA，該方法依據(jù)的原理是，通過這種方法獲得的基因中因缺乏和結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致將其直接導(dǎo)入受體細(xì)胞中不能復(fù)制和表達(dá)。
（2）與選用老葉相比，選用嫩葉更容易提取到mRNA，原因是，且提取RNA時，提取液中需添加RNA酶抑制劑，其目的是。
（3）將從cDNA文庫中獲得的幾丁質(zhì)酶基因和質(zhì)粒載體用酶和DNA連接處理后連接起來，構(gòu)建基因表達(dá)載體，DNA連接酶催化形成的化學(xué)鍵是。發(fā)布：2025/1/5 8:0:1組卷：5引用：1難度：0.7
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