重疊延伸PCR技術(shù)是采用具有互補末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴增片段重疊拼接起來的技術(shù)，可通過定點誘變在體外改造DNA分子，并將改造后的目的基因?qū)胭|(zhì)粒構(gòu)建目的基因表達(dá)載體。

（1）如圖所示的重疊延伸PCR技術(shù)中，PCR1的引物是

引物A、引物C

引物A、引物C

。PCR4可獲得大量定點誘變目的基因，此時的引物為

引物C、引物D

引物C、引物D

。PCR3時模板DNA不能選擇DNA分子③的原因是

子鏈的延伸方向只能從5’→3'，以DNA分子③作模板時子鏈不能延伸

子鏈的延伸方向只能從5’→3'，以DNA分子③作模板時子鏈不能延伸

。
（2）為使重疊延伸PCR技術(shù)改造后的目的基因（該基因序列不含圖中限制酶的識別序列）能與載體正確連接，PCR4時，應(yīng)在基因上、下游引物的

5′

5′

端分別添加限制酶

KpnⅠ、EcoRⅠ

KpnⅠ、EcoRⅠ

的酶切位點。
（3）將目的基因、質(zhì)粒及大腸桿菌混合，溫育一段時間后涂在含四環(huán)素的平板上培養(yǎng)，一段時間后平板上長出菌落。這些菌落的菌體內(nèi)

不一定

不一定

（填“一定”、“不一定”）含有目的基因，理由是

含有空白質(zhì)粒的大腸桿菌也能在該培養(yǎng)上生長

含有空白質(zhì)粒的大腸桿菌也能在該培養(yǎng)上生長

。