CAV-2（犬2型腺病毒）弱毒株廣泛應用于基因治療載體和病毒活疫苗載體研究。該病毒的E3區(qū)為病毒復制的非必需區(qū)，構建缺失E3區(qū)的CAV-2載體，可以提高CAV-2外源基因容量。過程如圖。
（1）過程①中擴增E3區(qū)上/下游同源重組臂的技術為PCRPCR技術，該技術中用到的關鍵酶是taqDNA聚合（taq）taqDNA聚合（taq）酶。設計擴增上游同源重組臂的1對引物時，分別引入EcoRⅠ位點和KpnⅠ、SpeⅠ位點。設計下游同源重組臂的1對引物時，分別引入KpnⅠ位點和HindⅢ位點。在反應體系中加入CAV-2基因組DNA的作用 作為模板作為模板。
（2）過程②中，上游同源重組臂經EcoRⅠ/KpnⅠEcoRⅠ/KpnⅠ酶切，下游同源重組臂經KpnⅠ/HindⅢKpnⅠ/HindⅢ酶切，再將他們與經EcoRⅠ/HindⅢ酶切的Puc18質粒連接在一起，形成pUC-△E3質粒。
（3）過程③中，設計兩端引物時，都引入SpeⅠSpeⅠ位點，經酶切得到的含EGFP（增強綠色熒光蛋白）等序列的DNA片段A。DNA片段A和pUC-△E3質粒經SpeⅠ酶切后，連接在一起。因為 連接方向可能錯誤（自身環(huán)化）連接方向可能錯誤（自身環(huán)化），所以還需經過鑒定和篩選才能得到pUC-△E3-EGFP質粒。
（4）CAV-2感染犬腎上皮細胞后，導入pUC-△E3-EGFP質粒，經多次純化后，得到重組的CAV-2病毒，這種病毒的變異類型屬于 基因重組基因重組。
（5）基因工程應用過程中，外源基因可能會與感染轉基因生物的某些病毒雜交，從而重組出對人類或其他生物有害的病原體，這是引發(fā)了人們在 生物生物安全方面發(fā)生了激烈的爭論的原因之一。
【考點】基因工程的操作過程綜合．
【答案】PCR；taqDNA聚合（taq）；作為模板；EcoRⅠ/KpnⅠ；KpnⅠ/HindⅢ；SpeⅠ；連接方向可能錯誤（自身環(huán)化）；基因重組；生物
【解答】
【點評】
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發(fā)布：2024/6/27 10:35:59組卷：7引用：1難度：0.7
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1．基因工程技術又稱為DNA重組技術，回答相關問題：
（1）在基因工程中，獲取目的基因主要有兩大途徑，即和從中分離．
（2）利用某植物的成熟葉片為材料，同時構建cDNA文庫和基因組文庫，兩個文庫相比，cDNA文庫中含有的基因數(shù)目比基因組文庫中的少，其原因是．
（3）在基因表達載體中，啟動子是聚合酶識別并結合的部位．若采用原核生物作為基因表達載體的受體細胞，最常用的原核生物是．
（4）將目的基因導入植物細胞時，采用最多的方法是法．發(fā)布：2024/12/29 8:0:2組卷：2引用：1難度：0.3 -
2．科研人員利用大腸桿菌構建了抗蟲基因文庫。最新研究發(fā)現(xiàn)漏斗蜘蛛中的AH基因控制合成的毒素肽具有顯著的殺蟲效果，現(xiàn)以p-B質粒為載體，構建 AH基因的cDNA文庫。圖1表示p-B質粒，其中Cm/表示氯霉素抗性基因，cdB 基因表達產物能抑制大腸桿菌 DNA 復制。圖中箭頭表示相關限制酶的酶切位點，且不同種限制酶識別序列不同，其中AiuI、XbaI、SspI和MfeⅠ識別的堿基序列和酶切位點分別是 AG'CT、T'CTAGA、AAT'ATT、C'AATTG。請分析并回答下列問題：
（1）為獲得AH基因的cDNA，先要從漏斗蜘蛛毒素肽分泌細胞中提取，再通過合成出AH基因的cDNA。若從漏斗蜘蛛其他組織細胞提取，則難以成功，原因是。
（2）若已知AH基因的cDNA兩端部分序列為：5'-AACTATGCGC……CGTAGCCTCT-3'，請寫出PCR擴增該cDNA時的兩個引物對應的局部序列（前10個堿基序列），并標明5'和3'端：，。一個初始雙鏈cDNA經四輪循環(huán)后，共消耗這兩種引物的數(shù)量為個。
（3）利用圖中的質粒和AH基因構建重組質粒時，宜選用限制酶雙酶切質粒，再選用限制酶切割目的基因，將切割后獲得的DNA片段混合，經DNA連接酶處理后，再與大腸桿菌混合培養(yǎng)，在含有適量氯霉素的培養(yǎng)基中添加適量冷的，以促進轉化。
（4）經上述處理培養(yǎng)后，其中能繁殖的大腸桿菌中應含有的質粒是，原因是。發(fā)布：2024/12/29 8:0:2組卷：8引用：1難度：0.6 -
3．基因治療是指將外源正?；驅氚屑毎约m正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達到治療的目的．干擾素基因缺失的小鼠不能產生成熟淋巴細胞，科研人員利用胚胎干細胞（ES細胞）對干擾素基因缺失的小鼠進行了基因治療．請回答：
（1）為使干擾素基因在小鼠細胞中高效表達，需要把來自cDNA文庫的干擾素基因片段正確插入基因表達載體的和之間．
（2）將干擾素基因導入ES細胞的方法是，采用可以鑒定目的基因是否插入到受體細胞染色體DNA分子上，再將能正常表達干擾素的細胞轉入到小鼠體內，這種治療方法稱為．導入ES細胞而不是導入上皮細胞是因為ES細胞在功能上具有．
（3）干擾素基因缺失的小鼠易患某種細菌導致的肺炎，引起這種現(xiàn)象的原因是小鼠缺少成熟的淋巴細胞，降低了小鼠免疫系統(tǒng)的功能．
（4）用于基因治療的基因有三類，一類是把正?；驅胗谢蛉毕莸募毎校员磉_出正常性狀來治療，第二類是反義基因，即通過產生的mRNA分子與病變基因產生的進行互補結合，來阻斷非正常蛋白質的合成；第三類是編碼可以殺死癌細胞的蛋白酶基因．發(fā)布：2024/12/29 8:0:2組卷：24引用：2難度：0.5
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