某種病毒的N蛋白（刺突蛋白）可與宿主細胞的受體結(jié)合，是決定病毒入侵易感細胞的關(guān)鍵蛋白。下表是兩種針對該病毒的疫苗研發(fā)的技術(shù)路線，請回答相關(guān)問題：

方法	技術(shù)路線
基因工程疫苗	N蛋白基因→基因表達載體→大腸桿菌→N蛋白→人體
腺病毒載體重組疫苗	N蛋白基因→腺病毒基因表達載體人體

（1）研究人員利用PCR技術(shù)特異性地擴增N蛋白基因，PCR過程中溫度的控制至關(guān)重要。將處理溫度控制在90～95℃，是為了

使雙鏈DNA解聚為單鏈

使雙鏈DNA解聚為單鏈

。
（2）在構(gòu)建基因表達載體的過程中，需要用兩種不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，目的是防止

目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化

目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化

以及目的基因和質(zhì)粒反向連接。構(gòu)建的基因表達載體上需要有啟動子、終止子、復(fù)制原點、

標記基因

標記基因

等結(jié)構(gòu)。將基因表達載體導入大腸桿菌，首先用

鈣離子（Ca²⁺）

鈣離子（Ca²⁺）

處理大腸桿菌細胞，使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中 DNA分子的生理狀態(tài)。
（3）基因工程疫苗制備過程中需要分離和提純大腸桿菌。通常情況下需要對培養(yǎng)基進行

高壓蒸汽（濕熱）

高壓蒸汽（濕熱）

滅菌。當采用平板劃線法分離大腸桿菌時，第二次及以后的劃線都要從上一次劃線的末端開始，其目的是

使微生物的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而減少，最終得到有單個細菌繁殖而來的菌落

使微生物的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而減少，最終得到有單個細菌繁殖而來的菌落

。
（4）制作腺病毒載體重組疫苗時需要將腺病毒的毒力相關(guān)基因除掉，刪除基因時需用到

限制

限制

酶，這種酶能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的

磷酸二酯

磷酸二酯

鍵斷開。與基因工程疫苗相比，腺病毒載體重組疫苗的優(yōu)點是能持續(xù)表達抗原，使人體免疫應(yīng)答更持久。