巢式PCR是一種特殊的聚合酶鏈式反應，使用兩組不同的引物實現(xiàn)目標DNA片段的擴增。第一組外引物擴增出的DNA片段（中間產(chǎn)物）長度超出目標區(qū)域，第二組內(nèi)引物稱為巢式引物，其結(jié)合部位在中間產(chǎn)物內(nèi)部的目標區(qū)域，從而擴增出目標產(chǎn)物，具體過程如圖1所示。請回答下列問題。

（1）巢式PCR反應體系中需加入模板、

Taq酶（耐高溫的DNA聚合酶）

Taq酶（耐高溫的DNA聚合酶）

、

dNTP（4種脫氧核苷酸）

dNTP（4種脫氧核苷酸）

、引物、Mg²⁺、緩沖液等。
（2）巢式PCR過程中反應溫度最低的一步是

復性（退火）

復性（退火）

。巢式PCR中外引物的第一階段擴增和內(nèi)引物的第二階段擴增通常在不同的離心管中進行，可防止

內(nèi)引物

內(nèi)引物

在第一階段PCR中與模板結(jié)合。
（3）若直接用圖1中的內(nèi)引物對模板DNA擴增，則內(nèi)引物與模板的非目標區(qū)域進行堿基互補配對的概率會

上升

上升

（填“上升”或“下降”），不易得到目標產(chǎn)物。巢式PCR獲得的產(chǎn)物特異性

高

高

（填“高”或“低”）。
（4）家畜胚胎性別鑒定對畜牧業(yè)發(fā)展具有重要意義，科研人員利用多重巢式PCR技術同時擴增奶牛Y染色體上雄性決定基因（SRY）和常染色體上的酪蛋白基因（CSN1S1），進行早期胚胎性別鑒定和胚胎移植，獲得高產(chǎn)奶牛。請完成下表相關內(nèi)容。

實驗目的	方法步驟要點
囊胚樣品DNA提取	選取 滋養(yǎng)層 滋養(yǎng)層 細胞提取DNA
PCR引物的設計和合成	根據(jù)牛的SRY和CSN1S1基因序列設計合成4對引物
PCR擴增	預變性→變性→復性→延伸
鑒定分析	采用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行鑒定，確定胚胎性別 采用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行鑒定，確定胚胎性別
同期發(fā)情處理 同期發(fā)情處理	對受體奶牛注射前列腺素
胚胎移植	將符合要求的胚胎移植到受體奶牛的子宮內(nèi)

（5）巢式PCR產(chǎn)物鑒定結(jié)果如圖2所示，1～5號為取自不同胚胎的DNA樣品，其中符合要求的胚胎是

1號、2號、4號

1號、2號、4號

。奶牛胚胎性別的鑒定下列方法也可行的是

①②④

①②④

。
①染色體核型分析法
②核酸探針雜交法
③差速離心法
④抗HY血清免疫學法（HY抗原編碼基因位于Y染色體上）