糖化酶是將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖的酶，大部分野生酵母菌因缺乏糖化酶基因而不能直接利用淀粉。研究人員將經(jīng)誘變處理后獲取的黑曲霉菌高產(chǎn)糖化酶基因?qū)氘叧嘟湍窯S115（對(duì)氨芐青霉素不敏感）中，構(gòu)建能直接利用淀粉的工程菌，該過(guò)程所用質(zhì)粒（僅示部分結(jié)構(gòu)）如圖1所示。質(zhì)粒的外側(cè)鏈為a鏈，內(nèi)側(cè)鏈為b鏈?；駻mp^r轉(zhuǎn)錄的模板鏈屬于b鏈的片段。三種限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)見(jiàn)下表。請(qǐng)回答下列問(wèn)題。
（1）為獲得糖化酶高產(chǎn)菌株，研究人員將經(jīng)誘變處理后的黑曲霉菌接種到

淀粉

淀粉

含量高的培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)適宜時(shí)間后滴加碘液，挑選出透明圈（不產(chǎn)生藍(lán)色）直徑

較大

較大

（填“較大”或“較小”）的菌株。再進(jìn)行復(fù)篩以及穩(wěn)定性遺傳實(shí)驗(yàn)。
（2）質(zhì)粒復(fù)制的模板鏈?zhǔn)?

a和b

a和b

（選填“a”、“b”、“a和b”、“a或b”）鏈。高產(chǎn)糖化酶基因插入質(zhì)粒后，其轉(zhuǎn)錄的模板鏈屬于

a

a

鏈的片段。

限制酶	BamHⅠ	PstⅠ		XbaⅠ
識(shí)別序列和切割位點(diǎn)（5'→3'）	G↓GATCC	C↓TGCAG		T↓CTAGA
			相關(guān)結(jié)構(gòu)： PAOXI：甲醇誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動(dòng)子 TAOXI：終止子 HIS4：組氨酸脫氫酶基因，其表達(dá)產(chǎn)物催化組氨酸合成 Orl：復(fù)制原點(diǎn) Ampr：氨芐青霉素抗性基因

（3）構(gòu)建高產(chǎn)糖化酶基因表達(dá)載體時(shí)，用限制酶切割質(zhì)粒pPIC9K，圖2是高產(chǎn)糖化酶基因示意圖（僅示部分堿基），為使其能定向插入表達(dá)載體并成功表達(dá)，引物應(yīng)包含

BamHI和XbaI

BamHI和XbaI

（BamHⅠ/PstⅠ/XbaⅠ）酶識(shí)別序列，則PCR擴(kuò)增時(shí)引物的減基序列為

①④

①④

。（多選）

①5'-TCTAGATCTGTTGAAT-3'②5'-TCTAGAAGACAACTTA-3'
③5'-CTGCAGCTTGGATGAT-3'④5'-GGATCCCTTGGATGAT-3'
⑤5'-GGATCCGAACCTACTA-3'⑥5'-CTCGAGTCTGTTGAAT-3'